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LES PROTÉINES TAU, thèse de Laetitia Wallois-Dupont, Janvier 1998, Université de Lille I

IV- CONCLUSION

LES PROTÉINES TAU par Laetita Wallois-Dupont

En 1963, deux équipes montraient indépendamment que les enchevêtrements neurofibrillaires (NFTs) étaient composés de structures filamenteuses accumulées dans le cytoplasme des neurones en dégénérescence (Kidd, 1963 ; Terry, 1963). Ces structures ont été appelées paires de filaments en hélice ou PHFs (pour le terme anglais Paired Helical Filaments) (Kidd, 1963). Les composants antigéniques majeurs de ces PHFs sont des protéines microtubulaires, les protéines tau (Brion et al., 1985 ; Delacourte and Défossez, 1986 ; Grundke-Iqbal et al. , 1986a ; Kosik et al. , 1986 ; Nukina et Ihara, 1986 ; Wood et al. , 1986).

Les protéines tau ont été les premières protéines associées aux microtubules identifiées. En 1975, Weingarten et collaborateurs ont purifié ces protéines tau et ont démontré leur association avec les microtubules. In vitro, elles favorisent l'assemblage de ces microtubules (Weingarten et al. , 1975). Mais, c'est la mise en évidence des protéines tau au sein des PHFs qui a conduit de nombreuses équipes à étudier le métabolisme de ces protéines.

III- 1- Structure du gène

Le gène des protéines tau n'est présent qu'en une seule copie chez l'Homme, la souris, le rat et le bœuf (Drubin et al., 1984 ; Neve et al., 1986 ; Himmler, 1989). Chez l'Homme, ce gène a été localisé par hybridation in situ sur le bras long du chromosome 17, à la position 17q21 (Neve et al. , 1986). Il s'étend sur 100 kpb (Andreadis et al., 1992) et contient 16 exons (Andreadis et al., 1992) (FIGURE 6). L'analyse du gène des protéines tau a permis d'identifier deux îles de CpG correspondant à des régions riches en nucléotides C et G. La première île est associée avec la région promotrice du gène localisée en amont de l'exon -1, et la deuxième est associée à l'exon 9 (Andreadis et al., 1992). Très récemment, deux équipes ont séquencé une région qui s'étend sur plus de 300 pb en amont de l'exon -1 (Andreadis et al., 1996 ; Sadot et al., 1996a). Son analyse révélait la présence de plusieurs séquences nucléotidiques reconnues par des facteurs de transcription capables d'activer (SP1, AP2) ou d'inhiber (GCF) la transcription (Andreadis et al., 1996). Les deux études montraient également l'absence de la séquence consensus TATA box, encore appelée Golberg Hogness Box, qui est généralement retrouvée de 25 à 35 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription (Andreadis et al., 1996; Sadot et al., 1996a). Cette séquence consensus n'est pas indispensable à l'initiation de la transcription du gène mais son absence augmente l'hétérogénéité de l'extrémité 5' des transcrits primaires ou pré-messagers. Une autre séquence, retrouvée habituellement chez les eucaryotes, la CAAT box, est également absente de la région séquencée. L'abondance des résidus C et G ainsi que l'absence de ces séquences consensus dans la région promotrice analysée sont souvent caractéristiques de gènes exprimés dans tous les tissus et appelés gènes domestiques pour le terme anglais "Housekeeping genes". Les travaux développés par Andreadis et collaborateurs (1996) tendraient à montrer l'implication de cette région de 300 pb dans l'expression ubiquitaire du gène tau et pourrait alors expliquer l'expression des protéines tau dans de nombreux tissus (Gu et al., 1996). Par contre, Sadot et collaborateurs (1996a) suggérent l'implication directe de cette région dans l'expression spécifique du gène tau dans les cellules de type neuronal. Un autre site d'initiation de la transcription semble également exister, ce qui impliquerait la présence de séquences promotrices supplémentaires localisées en amont de la séquence identifiée (Andreadis et al., 1996). Cette nouvelle séquence restant à déterminer pourrait être responsable de l'expression spécifique de tau dans les cellules d'origine neuronale. D'autres études complémentaires seront donc nécessaires pour conclure sur ces résultats contradictoires.

Le gène des protéines tau contient 16 exons (FIGURE 6) (Andreadis et al., 1992). dont la numérotation a été, à l'origine, établie établie chez le boeuf (Himmler, 1989).

Les exons 1, 4, 5, 7, 9, 11, 12 et 13 sont exprimés de manière constitutive. Bien que l'exon -1 soit retrouvé dans les différents transcrits de tau, il n'est jamais traduit (FIGURE 6).

L'exon 14 est également transcrit et, dans la majorité des cas, il n'est pas traduit. En effet, la plupart des transcrits tau maintiennent l'intron situé entre les exons 13 et 14, ce qui provoque rapidement l'apparition d'un codon stop. Chez la souris, l'épissage de cet intron conduit à l'expression d'une isoforme plus longue (Lee et al., 1988). Plus récemment, une plus grande hétérogénéité des isoformes de tau dans cette région a également été mise en évidence chez le rat, l'Homme et le boeuf. Cette hétérogénéité s'explique par des combinaisons multiples entre différents sites donneurs et accepteurs d'épissage localisés respectivement dans les exons 13 et 14 (Himmler, 1989; Sawa et al., 1994).

Par contre, les exons 2, 3 et 10 sont épissés de manière alternative et sont spécifiques du tissu cérébral adulte (Andreadis et al., 1992) (FIGURE 6). L'épissage alternatif de ces 3 exons produit 6 combinaisons différentes d'ARNmessagers (ARNm): 2-3-10-, 2+3-10-, 2+3+10-, 2+3+10+, 2+3-10+, 2-3-10+ (Goedert et al., 1989a,b; Himmler, 1989; Kosik et al., 1989). L'épissage de l'exon 3 est particulier puisqu'il ne peut être inséré dans les transcrits de tau que lorsque l'exon 2 est présent (Andreadis et al., 1995); la présence de l'exon 2 n'entraîne pas l'addition systématique de l'exon 3.

L'exon 4A a été identifié et localisé entre les exons 4 et 5 sur le gène humain des protéines tau et il présente une homologie d'environ 50% avec les exons 4A trouvés chez la souris et le rat (Goedert et al., 1992a; Couchie ou et al., 1992; Andreadis et al., 1992). Seuls les exons 6 et 8, hautement conservés dans les différentes espèces, n'ont jamais été décrits dans les transcrits tau chez l'homme. Par contre, l'exon 8 est exprimé chez le singe rhésus et le boeuf (Himmler, 1989; Nelson et al., 1996) et l'exon 6 a été également décrit chez le boeuf et dans une lignée de neuroblastomes de souris, les cellules N115 (Himmler, 1989; Couchie et al., 1992).

III- 2- Les différents transcrits

Trois transcrits des protéines tau de 2, 6 et 8 kb ont été identifiés (Drubin et al., 1988; Goedert et al., 1988, 1992b; Couchie et al., 1992; Wang et al., 1993). L'ARN messager de 2kb semble coder pour l'isoforme de tau retrouvée dans le noyau tandis que les transcrits de 6 et 8kb codent pour les isoformes cytoplasmiques et sont respectivement spécifiques des systèmes nerveux central et périphérique.

Les transcrits de 6 kb sont trouvés en grande quantité dans le système nerveux central (Drubin et al., 1984; Kosik et al, 1989) et sont constitués des 6 ARNm dont les combinaisons ont été précédemment décrites (FIGURE 7). Seul le plus petit transcrit, correspondant à la combinaison 2-3-10-, est retrouvé au stade fœtal alors que les 6 transcrits sont exprimés chez l'adulte. Chez le rat, ces transcrits de 6 kb sont également retrouvés, en faible quantité, dans le système nerveux périphérique au niveau des ganglions rachidiens (Goedert et al., 1992c; Georgieff et al., 1993).

Les transcrits codant pour les différentes isoformes de tau sont non seulement exprimés différemment en fonction du stade de développement mais également en fonction du type cellulaire . En effet, dans le cerveau adulte, les transcrits avec ou sans l'exon 10 sont trouvés dans les soma des cellules pyramidales de toutes les couches du cortex. Par contre, dans la formation hippocampique, tandis que les transcrits sans l'exon 10 sont détectés dans les cellules granulaires et pyramidales, les transcrits avec l'exon 10 ne sont pas détectés dans les cellules granulaires (Goedert et al., 1989a). La quantité de transcrits des protéines tau varie également au cours du développement (Takemura et al., 1991). Chez la souris, le niveau des transcrits tau diminue au cours du développement du cerveau. Cette diminution résulterait d'un changement de la stabilité des transcrits plutôt que du taux d'expression (Charrière-Bertrand et Nunez, 1992).

Bien que plus minoritaires que les transcrits de 6kb, les transcrits de 2 kb ont été mis en évidence dans deux lignées de neuroblastomes humains ainsi que dans le cerveau (Goedert et al., 1988; Wang et al., 1993). La région codante du messager de 2 kb serait identique à celle du transcrit de 6 kb trouvé dans le cerveau de fœtus, correspondant à la combinaison 2-3-10-. Ce transcrit de 2 kb, codant pour l'isoforme nucléaire de tau, se distinguerait de l'isoforme fœtale par la présence d'une extrémité 3' non traduite, ou 3'-UTR (pour le terme anglais: "3'-Untranslated Region"), plus courte comme cela a été suggéré chez le rat par Sadot et collaborateurs (1994). Cette région 3'-UTR pourrait intervenir dans la stabilité et le transport des ARNmessagers (Wang et al., 1993; Sadot et al., 1994). Ce messager diffère aussi par son extrémité 5'-UTR, suggérant différents sites d'initiation de transcription entre les transcrits de 2 kb et 6kb (Andreadis et al., 1996). Cette région 3'-UTR pourrait intervenir dans la stabilité et le transport des ARNmessagers (Wang et al., 1993; Sadot et al., 1994).

Les transcrits de 8 kb sont préférentiellement retrouvés dans le système nerveux périphérique, dans les cellules de pheochromocytome de rat, les PC12, ainsi que dans une lignée de neuroblastomes de souris, les cellules N115 (Couchie et al., 1992; Georgieff et al., 1992; Goedert et al., 1992c) (FIGURE 7). Ils ont été également mis en évidence dans la moelle épinière et la rétine (Georgieff et al., 1993). Ces transcrits de 8 kb sont à l'origine des protéines tau de haut poids moléculaire. Ils contiennent l'exon 4A, entre les exons 4 et 5, et plus rarement l'exon 6, présent entre les exons 5 et 7 (Couchie et al., 1992). Comme les autres transcrits tau, ces transcrits de 8 kb semblent être soumis à un épissage alternatif conduisant à plusieurs isoformes de protéines tau de haut poids moléculaire (Gache et al., 1993).

Chez l'adulte, différents transcrits des protéines tau sont exprimés dans les systèmes nerveux central et périphérique. Dans le cortex cérébral, certaines cellules pourraient être spécialisées dans l'expression de certaines isoformes (Goedert et al., 1989a). La transcription des messagers des protéines tau ainsi que l'épissage alternatif conduisant aux différents transcrits précédemment décrits, semblent donc être soumis à des régulations bien précises qui varieraient selon les types cellulaires.

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III- 3- Structure des protéines tau et leur expression

Dans le cerveau adulte humain, six isoformes des protéines tau sont exprimées (FIGURE 8). Ces 6 isoformes se différencient dans leur partie amino-terminale par la présence ou l'absence de 29 ou 58 acides aminés dues respectivement à l'insertion de l'exon 2 seul ou des exons 2 et 3 dans les ARNm. Ces 6 isoformes se distinguent dans leur partie carboxy-terminale par la présence de trois ou quatre domaines répétés de 31 ou 32 acides aminés. La présence de ce quatrième domaine résulte de l'insertion de l'exon 10 dans les transcrits des protéines tau (Goedert et al., 1989a,b). Il vient s'intercaler entre les deux premiers domaines répétés des isoformes de protéines tau contenant trois domaines répétés.

La taille de ces isoformes varie de 352 à 441 et le poids moléculaire, calculé à partir de leur séquence primaire, varie de 36,7 kDa et 45,8 kDa. Lorsque toutes ces protéines tau sont exprimées dans les bactéries de type Escherichia coli, elles migrent en gel SDS-PAGE comme six bandes dont le poids moléculaire apparent est supérieur et varie de 48 à 67 kDa; (Goedert et Jakes, 1990). Elles présentent donc une mobilité électrophorétique pouvant être attribuée à leur composition en acides aminés propres (Lichtenberg et al., 1989; Goedert and Jakes, 1990). Pour l'addition d'un insert amino- ou carboxy-terminal, de taille équivalente (inserts amino-terminaux de 29 acides aminés chacun; insert carboxy-terminal de 31 acides aminés), la présence d'un insert amino-terminal ralentit davantage la migration électrophorétique que l'insert carboxy-terminal.

Les protéines tau sont organisées en plusieurs régions qui ont différentes propriétés chimiques et physiologiques (FIGURE 9).

III- 3- 1- 1- Partie amino-terminale

Cette partie a une longueur variable qui résulte de l'insertion de 29 ou 58 acides aminés selon les isoformes. Ces acides aminés supplémentaires rendent cette extrémité amino-terminale hautement acide. L'extrémité amino-terminale n'est pas associée aux microtubules et constituerait un domaine de projection qui s'oriente vers l'extérieur du microtubule (Hirokawa et al., 1988). Ce domaine déterminerait l'espace entre microtubules adjacents (Chen et al., 1992).

III- 3- 1- 2- Partie centrale

Cette région est très riche en résidus prolyl et contient de nombreux sites de phosphorylation reconnus par différentes kinases. Cette région a été impliquée par des expériences de liaison in vitro (Gustke et al., 1994) mais aussi in vivo, après transfection de cellules non neuronales (Kanai et al., 1992; Lee et Rook, 1992). Trés récemment, Goode et collaborateurs (1997) ont localisé, dans cette région, une séquence de 7 acides aminés (Lys215- Arg221) capable d'influencer très fortement la capacité de liaison et d'assemblage des protéines tau aux microtubules.

III- 3- 1- 3- Partie carboxy-terminale

Cette région est très basique. Elle est responsable de l'interaction des protéines tau avec les microtubules. Cette extrémité carboxy-terminale contient 3 ou 4 séquences de 18 acides aminés hautement homologues (Lee et al., 1988; Goedert et al., 1989a; Himmler, 1989). En effet, la comparaison de ces séquences répétitives montre que 11 acides aminés sont identiques dans ces 4 séquences. Chacune de ces séquences contient un motif particulier de 4 acides aminés: Pro-Gly-Gly-Gly. Enfin, ces domaines répétés, séparés les uns des autres par 13 à 14 acides aminés, beaucoup moins bien conservés, sont appelés zones de jonction (pour le terme anglais: inter-repeat) (FIGURE 10). Ces domaines répétés au niveau des protéines tau présentent beaucoup d'homologie avec les autres MAPs

  FIGURE 10: Homologie des séquences en acides aminés entre les différents domaines de liaison aux microtubules. Les acides aminés identiques entre chaque domaine répété sont encadrés.  

L'expression des protéines tau est régulée au cours du développement. Ainsi, dans le système nerveux central, une seule isoforme est exprimée durant le développement embryonnaire et à la naissance; cette isoforme ne comporte aucune des insertions dans les régions amino- et carboxy-terminales décrites précédemment. C'est pourquoi cette isoforme est généralement appelée isoforme fœtale (Goedert et al., 1989a; Kosik et al., 1989) alors que les autres isoformes, apparaissant au cours du développement, seront toutes exprimées chez l'adulte mais en quantités inégales. Ainsi, certaines isoformes (A, B, C, D) sont dites majeures tandis que les formes les plus longues (E, F) sont retrouvées en quantités moins importantes (FIGURE 8) (Goedert and Jakes, 1990; Hasegawa et al., 1992). Chez le rat, l'isoforme la plus courte a été également mise en évidence dans le système nerveux périphérique durant le développement embryonnaire et pendant environ 7 jours, après la naissance (Georgieff et al., 1992; Oblinger et al., 1991).

Certaines protéines tau de poids et de structure semblables ont également été décrites dans le noyau des cellules, au niveau des sites de transcription des ARNribosomiques (Loomis et al., 1990; Wang et al., 1993; Brady et al., 1995). Ces protéines dérivent vraisemblablement des transcrits tau de 2 kb. Outre leur localisation nucléaire, ces protéines tau se différencient également par une insolubilité importante nécessitant, pour leur analyse en western blot, leur solubilisation en présence d'acide formique (Loomis et al., 1990). Avant d'être adressées vers le noyau, ces protéines tau sont probablement phosphorylées dans le cytoplasme (Greenwood et Johnson, 1995). Bien que leur localisation cellulaire suggère un rôle dans la biogénèse et/ou dans la fonction des ribosomes (Loomis et al., 1990), la fonction exacte de ces protéines tau reste à déterminer.

Le système nerveux périphérique et certaines lignées cellulaires expriment des protéines tau de plus haut poids moléculaire (Georgieff et al., 1991;Goedert et al., 1992) (FIGURE 11). Bien que minoritaires, ces protéines tau sont également présentes dans certaines régions du système nerveux central (Georgieff et al., 1993).

  FIGURE 11

Elles ont un poids moléculaire apparent de 110 à 130 kDa. La taille, plus importante, de ces protéines tau de plus haut poids moléculaire, par rapport aux protéines tau trouvées dans le cerveau, résulte de l'addition de l'exon 4A, qui code pour une séquence supplémentaire de 253 acides aminés chez l'Homme (Andreadis et al., 1992). La taille de cette insertion diffère selon les espèces (Andreadis et al., 1992; Goedert et al., 1992c; Couchie et al., 1992). De plus, les protéines tau de plus haut poids moléculaire trouvées dans une lignée de neuroblastomes, les cellules N115, présentent l'insertion d'une séquence de 66 acides aminés due à l'expression de l'exon 6 (Couchie et al., 1992).

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III- 4- Fonctions des protéines tau

Les neurones sont les unités fonctionnelles du système nerveux. Ces cellules hautement spécialisées sont caractérisées par une structure polarisée constituée d'un prolongement cellulaire, l'axone, et d'un compartiment somato-dendritique. L'architecture neuronale de même que le transport axonal sont essentiels pour le développement normal du neurone. Les microtubules qui forment l'un des trois réseaux fibreux constituant le cytosquelette stabilisent l'architecture neuronale permettant un transport axonal efficace. Les microtubules sont des structures dynamiques constituées d'un grand nombre de molécules protéiques de 50 kDa, appelées tubuline a et ß. Ces longs filaments creux, hautement instables (Walter et al., 1988), sont stabilisés grâce à des protéines qui se lient le long de ces polymères de tubulines; ces protéines sont appelées protéines associées aux microtubules (MAPs). Ces MAPs demeurent associées aux microtubules après des cycles de polymérisation et de dépolymérisation des tubulines et semblent directement impliquées dans le développement de la polarité neuronale. Certaines MAPs, les protéines tau, MAP2 et MAP4, possèdent des caractéristiques communes et agissent probablement par des mécanismes similaires. Les MAP2 et MAP4 présentent un plus haut poids moléculaire que les protéines tau. Les MAPs présentent au moins trois domaines répétés, localisés dans leur partie carboxy-terminale, flanqués de régions basiques riches en résidus prolyls. C'est grâce à ces domaines répétés, fortement homologues entre eux, que les MAPs se lient à la tubuline (Lewis et al., 1988; Chapin et Bulinski, 1992). Les protéines tau et MAP2 sont exprimées de manière prépondérante dans les cellules neuronales mais avec une compartimentation différente: les tau sont principalement localisées dans les axones tandis que MAP2 est plutôt localisée dans le compartiment somato-dendritique (Binder et al., 1985; Riederer et Matus, 1985). Par contre, MAP4 est retrouvée largement exprimée dans différents types cellulaires et tissulaires non-neuronaux (Bulinski et Boriski, 1980; Parysek et al., 1984).

Les protéines tau présentent une structure semblable chez des mammifères appartenant à des ordres différents: celui des rongeurs pour le rat et la souris, celui des ongulés pour la chèvre et le vache et celui des primates pour l'homme et le singe Rhésus. Plus récemment, un gène codant pour une protéine possédant un nombre variable de domaines répétés et présentant une homologie avec le gène tau humain a également été décrit chez le ver Caenorhabditis elegans (Mac Dermott etal. 1996). L'expression de ce gène ptl-1, dans des bactéries, mais aussi dans des cellules Sf9, conduit à la synthèse de protéines capables, comme les protéines tau, de se lier in vitro aux microtubules (Mac Dermott etal. 1996; Goedert et al., 1996). Cette conservation phylogénétique laisse présager un rôle important pour ces protéines.

Initialement, les protéines tau ont été identifiées en tant que protéines capables in vitro de stimuler l'assemblage des microtubules (Weingarten et al., 1975; Cleveland et al., 1977a,b). In vivo, les protéines tau sont colocalisées avec les microtubules dans les neurones (Binder et al., 1985; Drubin et al., 1986; Kosik et Finch, 1987). Lorsqu'elles sont microinjectées ou synthétisées après transfection dans des cellules non neuronales, comme les cellules COS, les cellules CHO, cellules L, ces protéines tau stabilisent et favorisent la croissance des microtubules ainsi que la formation de faisceaux de microtubules (Drubin et Kirschner, 1986; Drubin et al., 1986; Kanai et al., 1989; Lee and Hook, 1992; Lewis et al., 1989; Takemura et al, 1992; Barlow et al., 1994). Cependant, dans d'autres types cellulaires, comme les cellules 3T3, bien que la colocalisation des protéines tau avec les microtubules soit effectivement constatée, il peut n'y avoir aucune différence de morphologie cellulaire ou d'augmentation de faisceaux de microtubules (Gallo et al., 1992; Lo et al., 1993; Haque et al., 1995). La concentration de tubuline non associée aux microtubules ainsi que des interactions entre les MAPs et la tubuline pourraient réguler l'assemblage des microtubules. La surexpression de tau peut, dans les cellules non neuronales, provoquer un plus haut niveau de tubuline (Kanai et al., 1989; Montejo de Garcini et al., 1994). Les protéines tau pourraient favoriser l'assemblage de la tubuline en microtubules en diminuant l'instabilité de la tubuline (Drechsel et al., 1992). Les protéines tau protègent également les microtubules existants de l'action dépolymérisante de certaines toxines comme la colchicine ou le nocodazole (Lee and Hook, 1992; Lo et al., 1993; Baas et al., 1994). Le rôle des protéines tau dans la stabilisation des microtubules est important pour l'établissement et le maintien du transport axonal, essentiel à la vie du neurone (Drubin et al., 1986; Goedert et al., 1991).

L'expression des protéines tau dans des cellules non neuronales peut conduire à une redistribution des microtubules du cytosquelette en épais faisceaux de microtubules contenant les protéines tau (Lewis et al.,1989; Kanai et al., 1989). Alors que les microtubules semblaient originaires d'un centre organisateur et irradiaient dans la cellule à partir de ce centre, la transfection des protéines tau conduit à une réorganisation des microtubules en faisceaux à la circonférence des cellules non neuronales (Baas et al., 1991; Lovestone et al., 1994; Wagner et al., 1996). Cette réorganisation pourrait altérer le fuseau mitotique et aussi modifier les divisions cellulaires, provoquant la formation de cellules polynucléées (Montejo de Garcini et al., 1994).

La stabilisaton des microtubules, la formation de faisceaux de microtubules, ainsi que la rigidité des réseaux microtubullaires cellulaires, sont trois propriétés essentielles pour le développement de prolongements cellulaires. Les protéines tau sont capables d'induire le développement de longs prolongements dont l'organisation microtubullaire est semblable à celle observée dans un axone (Baas et al., 1991; Knops et al.,1991; Chen et al, 1992). In vivo, la présence des protéines tau ne semble pas indispensable lors de l'axogénèse. En effet, leur absence chez des souris pourrait être compensée par l'action d'autres MAPs, comme MAP1B (Harada et al., 1994; Shastry, 1994). Le développement de tels prolongements celluaires semble directement lié au taux d'expression important des protéines tau dans les cellules d'insectes Sf9 transfectées (Baas et al., 1991; Knops et al.,1991; Chen et al, 1992). Dans d'autres types cellulaires, comme les PC12, l'induction de l'expression des protéines tau, après traitement par le NGF (pour le terme anglais Nerf Growth Factor) des cellules ou après transfection, a également pour conséquence la croissance de neurites (Drubin et al., 1985; Esmaeli-Azad et al., 1994; Leger et al., 1994). Cette induction semble directement liée aux protéines tau, puisque des antisens, annulant leur expression, suppriment également ces prolongements (Hanemaaijer and Ginzburg, 1991; Esmaeli-Azad et al., 1994). Enfin, les protéines tau ont également un rôle dans l'établissement de la polarité neuritique de neurones cérébelleux en culture primaire (Caceres and Kosik, 1990; Caceres et al., 1991). En revanche, dans d'autres types cellulaires, l'expression des protéines tau ne semble pas suffisante pour induire de telles extensions (Langkopf et al., 1995).

Dans le cerveau humain, au stade foetal, où la plasticité neuronale est importante pour établir les connexions, seule, l'isoforme la plus petite est exprimée. Dans le cerveau adulte, cette plasticité diminue au profit d'une stabilisation et d'une plus grande rigidité des microtubules, deux propriétés indispensables, pour maintenir les longues connexions établies. Les six isoformes de tau sont alors exprimées. C'est pourquoi une différence de fonction peut facilement s'imaginer entre l'isoforme foetale et les cinq autres isoformes. Chez l'adulte en revanche, le rôle précis de chacune des isoformes est plus délicat à interpréter. C'est pourquoi, les différentes régions constituant les protéines tau ont été largement étudiées in vitro mais, également, dans certaines cellules après transfection. Ces études ont permis de déterminer deux grands domaines fonctionnels sur les protéines tau: le domaine amino-terminal, représentant le domaine de projection des protéines tau, et le domaine carboxy-terminal, représentant le domaine responsable de l'activité d'assemblage des microtubules. Cette séparation fonctionnelle des protéines tau en deux domaines est réellement obtenue par un clivage limité des protéines tau par la chymotrypsine. Cette coupure se fait au niveau du résidu 198 et sépare la protéine en deux parties: le domaine amino-terminal (qui s'étend du premier résidu jusqu'à la tyrosine 197) et le domaine carboxy-terminal (s'étendant des résidus 198 à 441) (Steiner et al., 1990) (FIGURE 9).

III- 4- 3- 1- Le domaine amino-terminal ou domaine de projection

La surexpression de tau, dans des fibroblastes d'isoformes transfectées, comportant les inserts amino-terminaux acides (FIGURE 9), provoque la formation de réseaux de microtubules disposés en faisceaux parallèles plus efficacement que les isoformes de tau sans ces inserts (Kanai et al., 1992). Cette fonction a été également confirmée par des tests de liaison in vitro (Gustke et al., 1994). De plus, cette région amino-terminale, retrouvée projetée à partir de la surface des microtubules, détermine l'espace entre les microtubules adjacents (Hirokawa et al., 1988; Chen et al., 1992). Dans l'axone, où les protéines tau sont localisées de manière prédominante, l'espacement entre les faisceaux est de 20nm alors qu'il est beaucoup plus grand dans les dendrites (60-100nm) où MAP2 est exprimée (Goedert et al., 1991). Cet espacement est important pour le passage des vésicules de transport le long de l'axone. L'insertion de 253 acides aminés dans ce domaine amino-terminal, au niveau des protéines tau de haut poids moléculaire du système nerveux périphérique, pourrait permettre à ces protéines de maintenir un espace supérieur entre les microtubules à celui observé dans le système nerveux central (Frappier et al., 1994).

Plus récemment, Brandt et collaborateurs (1995) ont rapporté l'interaction des protéines tau avec certains composants de la membrane plasmique du neurone et de certains organites comme les mitochondries, via ce domaine de projection. Ces interactions semblent intervenir dans le développement neuritique (Brandt et al., 1995). Par ces interactions avec la membrane, les protéines tau pourraient réaliser la jonction entre les informations extracellulaires et les microtubules cellulaires .

Cette région pourrait avoir un autre rôle au niveau du développement puisque les protéines Eed (embryonic ectoderm development) se lient par cette région aux protéines tau (Lee et al., 1996). Cette protéine Eed joue un rôle important au niveau du développement de la souris (Schumacher et al., 1996).

III- 4- 3- 2- Le domaine carboxy-terminal ou domaine d'assemblage

Ce domaine s'étend du résidu 198 au résidu 441 selon la numérotation des acides aminés composant la plus longue isoforme de tau.

Il peut-être divisé en 3 régions:

- une région riche en proline (région comprise entre les résidus 198 et 244),

- la région des séquences répétitives (région comprise entre les résidus 244 et 368),

- une région carboxy-terminale (région comprise entre les résidus 369 et 441) (Gustke et al., 1994) (FIGURE 9).

Cette dernière région comporte une séquence qui pourrait être assimilée à une cinquième séquence répétitive du fait de sa composition; elle s'étend du résidu 369 au résidu 400. Sa présence est nécéssaire pour l'association de l'isoforme la plus courte avec les microtubules dans les cellules CHO (Lee and Rook, 1992). Comme nous l'avons déjà décrit, le domaine carboxy-terminal est variable et peut comprendre 3 ou 4 domaines répétés qui favorisent la liaison des protéines tau aux microtubules (Lee et al., 1989). L'ordre de ces domaines répétés n'est pas important pour leur fonction (Trinczek et al., 1995) et chacune de ces séquences contribue, avec une affinité variable, à la liaison des protéines tau aux microtubules (Butner and Kirschner, 1991; Lee and Rook, 1992; Goode and Feinstein, 1994; Gustke et al., 1994). L'addition du quatrième domaine répété permet une polymérisation plus rapide des microtubules.

En effet, son insertion:

1) augmente l'épaisseur des prolongements neuritiques,

2) permet un assemblage plus efficace des microtubules et leur confère une plus forte stabilité (Goedert et Jakes, 1990; Scott et al., 1991; Kanai et al., 1992; Brandt et Lee, 1993).

Les isoformes, avec 4 domaines répétés, présentent l'addition de la zone de jonction entre les deux premières séquences répétitives, et, plus spécifiquement, le peptide KVQIINKK dont la forte affinité pour les microtubules a été récemment démontrée (Goode et Feinstein, 1994; Trinczek et al., 1995). Cette zone de jonction interagirait avec la tubuline, grâce à des interactions ioniques impliquant les résidus lysyl positionnées en 274 et 281, sur l'isoforme la plus longue des protéines tau (Goode et Feinstein, 1994). De plus, un peptide, comprenant le premier domaine répété et cette zone de jonction, est capable de reproduire l'action de l'isoforme tau complète sur la polymérisation des microtubules (Panda et al., 1995). L'activité de ces 3 ou 4 domaines répétés est modulée négativement par l'addition des inserts amino-terminaux (Scott et al., 1991).

La région riche en proline module également l'affinité des protéines tau pour les microtubules dans des expériences in vitro et également in vivo (Lewis et al., 1989; Lee and Rook, 1992; Gustke et al., 1994). L'interaction des protéines tau avec la tubuline ne semble pas directe, puisque les peptides, ne comprenant que cette région, ne se lient que très faiblement aux microtubules (Butner and Kirschner, 1991; Goode et Feinstein, 1994; Gustke et al., 1994). En fait, cette région agirait en modulant l'activité des domaines répétés, favoriserait la capacité de nucléation des protéines tau (Brandt et Lee, 1993) et le développement de prolongements de cellules PC12 (Leger et al., 1994). La région s'étendant des résidus 154 à 173 (sur l'isoforme la plus courte) est très bien conservée phylogénétiquement mais également au niveau d'autres MAPs, telle que MAP2, suggérant donc un rôle important de cette région dans les fonctions des protéines tau. Très récemment, l'activité de cette région, riche en proline, a été localisée entre les résidus 215 et 246 et, plus précisément, au niveau de la séquence KKVAVVR. Cette région exerce une forte influence sur les activités de liaison et d'assemblage des isoformes comportant 3 ou 4 domaines répétés (Goode et al., 1997).

Par ailleurs, les protéines tau pourraient être impliquées dans l'induction de cascades liées à l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4, 5- biphosphate. En effet, la séquence riche en résidus prolyl, codée par l'exon 9, pourrait se lier à la phospholipase Cg et provoquer son activation en présence d'acide arachidonique (Hwang et al., 1996).

La combinaison de la région riche en proline et du domaine R', assimilé à un domaine répété supplémentaire, favoriserait l'interaction des domaines répétés avec les micotubules en permettant l'adoption d'une conformation protéique adéquate. Ces régions seraient, elles-mêmes, capables de se lier au protofilament adjacent, renforçant ainsi la liaison des protéines tau aux microtubules. Ce modèle de liaison des protéines tau aux microtubules, appelé le "jaws model", a été proposé par l'équipe de Mandelkow (FIGURE 12). L'interaction des protéines tau avec les microtubules pourrait être réduite à une interaction électrostatique entre les domaines de tau chargés positivement (région riche en proline, les domaines répétés et le domaine R') et la région C-terminale acide de la tubuline. Le domaine de projection, de même que la queue C-terminale de tau (constituée par les quarante derniers acides aminés), pourraient également moduler cette interaction. L'effet est particulièrement visible pour la queue C-terminale qui est antagoniste à la liaison de tau aux microtubules (Gustke et al., 1994).

Les interactions entre les MAPs et les microtubules traités par la subtilisine suggèreraient que les extrémités carboxy-terminales des tubulines a et ß ne sont pas à l'origine de la liaison des MAPs aux microtubules. Cependant, ces interactions demeurent possibles et pourraient être impliquées dans la formation des faisceaux de microtubules induite par les MAPs (Saoudi et al., 1995). En fait, la liaison des protéines tau aux tubulines a et ß serait modulée par le nombre de résidus glutamyl (pouvant varier de 1 à 6) présents à l'extrémité carboxy-terminale des isotubulines. Ainsi, l'affinité des protéines tau est faible pour une tubuline non modifiée mais elle augmente lorsque l'isotubuline porte de un à trois résidus glutamyl. Cette liaison atteint une valeur optimale qui diminue progressivement lorsque la chaîne polyglutamylée s'allonge (Boucher et al., 1994). L'affinité des isotubulines pour les protéines tau pourrait être modulée par des changements conformationnels, résultant du nombre de résidus glutamyl à leur extrémité C-terminale (Larcher et al., 1996). Ce mécanisme a été également trouvé pour une autre protéine microtubulaire, la kinésine, soulignant donc l'importance de la tubuline dans la liaison des microtubules avec les protéines associées aux microtubules (Larcher et al., 1996).

Enfin, les protéines tau favoriseraient la polymérisation de la tubuline en facilitant la liaison du GTP à la sous-unité b de la tubuline (Khatoon et al., 1995).

III- 5- Rôle de la phosphorylation des protéines tau

Le taux de phosphorylation des protéines résulte des activités conjointes de kinases et de phosphatases au sein de la cellule. Elle représente une des modifications post-traductionnelles, les plus fréquentes, dans les cellules eucaryotes et permet le contrôle d'une multitude de fonctions cellulaires (Hunter, 1987; Edelman et al., 1987).

En 1983, Selden et Pollard montraient que les protéines microtubulaires tau, étaient des protéines phosphorylées (Selden et Pollard, 1983). Cette phosphorylation constitue la principale modification post-traductionnelle des protéines tau (Cleveland et al., 1977a,b). De plus, les protéines tau issues du cerveau fœtal sont phosphorylées sur des sites plus nombreux que les protéines tau exprimées dans le cerveau adulte suggérant une régulation de la phosphorylation au cours du développement.

L'identification des sites phosphorylés sur les protéines tau adultes et fœtales a été réalisée grâce à différentes techniques: la spectrométrie de masse et le séquençage peptidique (Hasegawa et al., 1992; Watanabe et al., 1993; Morishima-Kawashim et al., 1995), et l'utilisation de sondes immunologiques (pour revue: Lee 1995) (FIGURE 13, Tableau II) initialement développées dans différents laboratoires pour l'étude de la phosphorylation des protéines tau-PHF. Toutes les sondes immunologiques spécifiques sont capables de distinguer des sites phosphorylés ou non sur les protéines tau (Tableau II). La numérotation des acides aminés, utilisée pour décrire les différents sites de phosphorylation, correspond à celle de l'isoforme la plus longue des protéines tau humaines, c'est-à-dire à l'isoforme possédant les inserts amino- et carboxy-terminaux (Goedert et al., 1989a).

En 1994, Matsuo et collaborateurs ont décrit que le degré de phosphorylation des protéines tau adultes était plus important que celui couramment décrit. En fait, la phosphorylation, apparemment plus faible, des protéines tau, provenant du tissu cérébral normal autopsique, résultait des activités phosphatasiques endogènes restées très actives durant le délai post-mortem (Matsuo et al., 1994; Mawal-Dewan et al., 1994; Buée-Scherrer et al., 1996). Les protéines tau extraites de tissu cérébral fœtal ne sont pas soumises à cette déphosphorylation du fait de la plus faible activité des protéines phosphatases endogènes (Matsuo et al., 1994; Mawal-Dewan et al., 1994; Buée-Scherrer et al., 1996). Cette activité augmente après la naissance.

Ainsi, les protéines tau adultes sont retrouvées phosphorylées sur au moins 9 sites: Thr181, Ser199, Ser202, Thr205, Thr231, Ser 235, Ser262, Ser396 et la Ser404 (Watanabe et al., 1993; Matsuo et al., 1994; Seubert et al., 1995) (FIGURE 14). En plus de l'ensemble de ces sites, la protéine tau fœtale peut être phosphorylée sur 5 autres résidus: Ser198, Thr217, Ser400, Ser409 et la Ser413 (FIGURE 14). A l'exception de la Ser262, qui est située au début du premier domaine répété, tous ces sites de phosphorylation sont localisés de part et d'autres des régions responsables de la liaison directe aux microtubules (FIGURE 14). Les protéines tau adultes autopsiques contiennent entre 1,9 et 2,8 moles de phosphate par mole de tau selon les études (Ksiezak-Reding et al., 1992; Köpke et al., 1993) tandis que les protéines tau fœtales en contiennent en moyenne 7 moles (Kenessey and Yen, 1993). De plus, la séparation des protéines tau adultes autopsiques par électrophorèse bi-dimensionnelle (2-D) révèle la présence d'une vingtaine de protéines tau dont le point isoélectrique (pI) est compris entre 6,5 et 8,5 (Cleveland et al., 1977a,b). L'ensemble de ces données suggère donc que ces protéines tau sont phosphorylées de manière hétérogène: chaque molécule de tau fœtale ou de tau adulte n'est pas phosphorylée sur l'ensemble des sites précédemment cités mais seulement sur certains d'entre eux. De plus, la déphosphorylation des protéines tau, avant leur séparation en 2-D, diminue le nombre de variants, confirmant leurs différents états de phosphorylation mais suggérant également la présence d'autres modifications post-traductionnelles (Janke et al., 1996).

La plupart de ces sites de phosphorylation sont des résidus séryl ou thréonyl, suivis par des prolyl, suggérant l'implication de kinases spécifiques des motifs Ser-Pro ou Thr-Pro dans la phosphorylation des protéines tau. Ces kinases sont plus couramment regroupées sous le terme de PDPK (pour le terme anglais "proline-directed protein kinase"). La phosphorylation des protéines tau peut également se faire sur des résidus séryl ou thréonyl qui ne sont pas suivis par une prolyl; ces sites sont moins nombreux. Les kinases, potentiellement candidates à la phosphorylation de ces sites, sont regroupées sous le terme générique de non-PDPK (pour le terme anglais "non-proline-directed protein kinase"). Dans un premier temps, un grand nombre de kinases, PDPK ou non PDPK, ont été purifiées puis testées pour leur capacité à phosphoryler les protéines tau in vitro. Dans un deuxième temps, l'activité de certaines de ces kinases a été analysée au niveau de cellules en culture après stimulation par certaines substances ou après transfection de leur ADNc.

III- 5- 2- 1- les PDPK

La glycogène synthase kinase-3, ou GSK-3, sous sa forme GSK-3a (Yang et al., 1993a,b) ou sous sa forme GSK-3ß/TPKI (Ishiguro et al., 1992; Hanger et al., 1992, Singh et al., 1996), les kinases dépendantes des cyclines comprenant cdc-2, cdk2 et cdk5, (Vulliet et al., 1992; Baumann et al., 1993; Paudel et al., 1993), la kinase activée par des mitogènes ou MAP kinase (encore appelée ERK2) (Drewes et al., 1992), et plus récemment des protéines kinases activées par un stress et reliées aux MAP kinases, appelées SAP Kinases (Reynolds et al., 1997a,b), font partie des kinases capables de phosphoryler in vitro les protéines tau sur certains de ces sites (Tableau III). Bien que reconnaissant les deux motifs Ser-Pro et Thr-Pro, certaines kinases, comme la kinase GSK-3, phosphorylent préférentiellement les motifs Ser-Pro. De plus, leur phosphorylation ne semble pas être limitée à la présence d'une prolyl dans la séquence cible, puisque la kinase GSK3ß peut également phosphoryler la Ser413, qui n'est pas suivie par une proline (Ishiguro et al., 1992). Tous les résidus phosphorylés par ces kinases PDPK sont situés de part et d'autre des domaines de liaison aux microtubules.

III- 5- 2- 2- Les non-PDPK

Les motifs Ser/Thr, non suivis d'une prolyl, ont été également retrouvés phosphorylés sur les protéines tau in vitro par certaines kinases.

Différentes études ont montré que les kinases activées par un second messager:

- la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) (Litersky et Johnson, 1992; Scott et al., 1993),

- la protéine kinase dépendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMPK II) (Baudier et Cole, 1987; Steiner et al., 1990; Johnson, 1992; Singh et al., 1994,1996),

- la PKC (Baudier et al., 1987; Correas et al., 1992; Singh et al., 1994; Drewes et al., 1995),

- la caséine kinase I (CKI) (Singh et al., 1994, 1995),

- la caséine kinase II (CKII) (Greenwood et al., 1994),

- la phosphorylase kinase qui dépend du Ca2+ (Paudel et al., 1997)

sont capables de phosphoryler certains résidus sur les protéines tau (Tableau III).

Une autre kinase dépendante de l'ADN double brin (DNA-PK pour le terme anglais "double-stranded DNA-stimulated protein kinase") a été décrite par Wu et collaborateurs (1993) comme phosphorylant les protéines tau également. Certaines de ces kinases sont capables de phosphoryler, faiblement, les protéines tau sur des sites situés dans les domaines de liaison aux microtubules, et notamment sur la Ser262 (Singh et al, 1996). La phosphorylation de cette Ser262 semble importante dans la régulation de la liaison des protéines tau aux microtubules (Biernat et al., 1993; Drewes et al., 1995) et se ferait, in vitro, de manière spécifique, par une protéine de 110kDa, appelée MARK (Drewes et al., 1995). Cette kinase reconnaîtrait les résidus Séryl localisés dans une séquence peptidique de type KIGS mais également, dans une moindre mesure, le résidu Séryl présent dans la séquence KCGS. En effet, ces motifs sont trouvés au niveau des quatre domaines répétés des protéines tau et la MARK semble phosphoryler préférentiellement les résidus Ser262 et 356 qui appartiennent à un motif de type KIGS (Drewes et al., 1995). A ce jour, hormis cette Ser262, les autres sites n'ont pas été retrouvés phosphorylés sur les protéines tau adultes et foetales.

La phosphorylation des protéines tau peut être modulée in vitro par:

(1) L'ajout de certaines protéines:

Ainsi, la phosphorylation des protéines tau par la PKA ou la GSK3 est stimulée par l'ajout d'héparine ou d'héparane sulfate dans le milieu réactionnel (Mawal-Dewan et al., 1992; Brandt et al., 1994; Yang et al., 1994). L'addition d'héparine favorise la phosphorylation in vitro de tau par la GSK-3a, en 5 sites supplémentaires: Thr212, Thr231, Ser262, Ser324 et Ser356; les 3 derniers résidus étant situés dans les domaines de liaison aux microtubules (Yang et al., 1994). L'ajout de tubuline pourrait avoir également cet effet (Moreno et al., 1995). Par contre, le traitement de neurones en culture ou de cerveau de rat par du lithium, un inhibiteur de la GSK3, bloque la phosphorylation ainsi que l'hyperphosphorylation des protéines tau induite par le traitement par l'acide okadaïque, un inhibiteur des phosphatases (Munoz-Montano et al., 1997). Précédemment, Baudier et Cole (1987) avaient rapporté l'effet activateur de certains phospholipides (phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine) sur l'activité kinasique de la CaMPK II vis-à-vis des protéines tau. D'autres phospholipides, comme le phosphatidylinositol, pourrait avoir l'effet inverse.

(2) La préphosphorylation par une autre kinase:

L'activité kinasique de certaines protéines kinases PDPK et non-PDPK est optimisée lorsque les protéines tau ont été préalablement phosphorylées par l'une de ces kinases (Singh et al., 1995, 1996). Ainsi, la préphosphorylation des protéines tau par la kinase cdk5, d'origine neuronale, favoriserait leur phosphorylation par la GSK-3 kinase (Ishiguro et al., 1992; 1995; Sengupta et al., 1997). Cette phosphorylation par cdk5, sur les résidus Ser202, Thr205, Ser235 et Ser404, pourrait modifier la conformation des protéines tau, de manière à présenter à la kinase GSK-3 des résidus voisins, les Ser199, Thr231, Ser396 et Ser413, qui sont effectivement phosphorylés in vitro par la GSK-3 . L'activité kinasique de la GSK-3 est également augmentée par la préphosphorylation des protéines tau par d'autres kinases non-PDPK, comme la PKC, la PKA ou la CK II (Singh et al., 1995). A l'inverse, deux membres des kinases non-PDPK, les kinases CK-I et CaMK II, pourraient inhiber la phosphorylation des protéines tau par la GSK-3, in vitro (Singh et al., 1995), ou encore la PKA aurait également une action inhibitrice sur l'activité de la PK40erk (Blanchard et al., 1994).

(3) La structure par elle-même des protéines tau:

Ainsi l'addition des inserts dans la partie amino-terminale, codés par les exons 2 et 3, semble augmenter l'extension de la phosphorylation par la GSK-3, la CK I et la CaMK II (Singh et al., 1996). Par contre, la présence de l'insert carboxy-terminal, codé par l'exon 10, aurait l'effet inverse (Singh et al., 1997).

Le nombre et la nature des inserts ainsi que l'état initial de phosphorylation des protéines tau semblent moduler la phosphorylation, in vitro, des protéines kinases. Ces enzymes pourraient donc agir en synergie pour obtenir, in vitro, la phosphorylation des protéines tau sur la plupart des résidus phosphorylés in vivo.

La réversibilité de la phosphorylation des protéines est un mécanisme biochimique ubiquitaire, impliqué dans la régulation du comportement cellulaire. Ce mécanisme est appelé déphosphorylation.

Des données récentes montrent une déphosphorylation rapide des protéines tau par les phosphatases endogènes présentes dans le cerveau adulte et dans des cellules de neuroblastomes (Garver et al., 1994; Matsuo et al., 1994; Buée-Scherrer et al., 1996; Soulié et al., 1996). A ce jour, seuls les résidus Ser et Thr sont retrouvés phosphorylés sur les protéines tau, suggérant la régulation de la phosphorylation de ces sites par des protéines phosphatases (PP) également dirigées contre des résidus Ser/Thr. Ces PP sont classées en 4 groupes selon leur spécificité envers leur substrat, leurs activateurs et inhibiteurs: PP1, PP2A, PP2B encore appelée calcineurine, et PP2C (Cohen, 1991). Toutes ces protéines phosphatases sont présentes dans le cerveau, mais peuvent être différemment exprimées au cours de la vie (Dudek and Johnson, 1995).

III- 5- 3- 1- Protéine phosphatase 1 ou PP1

Les protéines phosphatases de type 1 ou PP1 sont constituées par l'association d'une sous-unité catalytique et d'une sous-unité régulatrice. La diversité des protéines phosphatases de type 1 résulte de l'existence de plusieurs isoformes de cette sous-unité régulatrice (pour revue: Walter and Munmby, 1993). L'action phosphatasique de PP1 peut être bloquée par certaines toxines, extraites d'éponges marines, à des concentrations précises: l'acide okadaïque (100nM) et la calyculine A (50nM). La PP1 a été impliquée dans la déphosphorylation des protéines tau (Yamamoto et al., 1988, 1995).

III- 5- 3- 2- Protéine phosphatase 2A ou PP2A

Cet enzyme est composé de trois sous-unités ayant chacune un rôle bien déterminé:

- une sous-unité structurale (la sous-unité A),

- une sous-unité catalytique (la sous-unité C)

- une sous-unité régulatrice (la sous-unité B).

Plusieurs PP2A ont été décrites résultant de l'association de différentes sous-unités régulatices B à la forme hétérodimérique AC de la PP 2A (pour revue: Walter and Munmby, 1993). Cette sous-unité B va réguler l'activité phosphatasique et la spécificité de la PP 2A (Kamibayashi et al., 1992, 1994). Cette protéine phosphatase peut être inhibée par l'acide okadaïque (concentration inhibitrice: 1-10 nM), la calyculine A (concentration inhibitrice: 1-5 nM), ou la tautomycine (produite par Streptomyces spiroverticillatus).

In vitro, la PP2A est capable de déphosphoryler efficacement les protéines tau recombinantes préalablement phosphorylées par certaines kinases de type PDPK (Goedert et al., 1992b, 1995; Drewes et al., 1993). La déphosphorylation endogène des protéines tau dans des cellules de type neuronal, provoquée ou non par des agents dépolymérisants, comme la colchicine ou le nocadazole, pourrait être médiée par cette protéine phosphatase, la PP2A (Fleming and Johnson, 1995; Merrick et al., 1996). Elle déphosphorylerait spécifiquement les protéines tau au niveau des résidus Ser202 et Thr205 (Merrick et al., 1996). Cette phosphatase est retrouvée associée aux microtubules dans un grand nombre de lignées cellulaires, d'origine neuronale ou non. Cette localisation présente la phosphatase en bonne candidate pour la déphosphorylation des protéines tau in vivo (Sontag et al., 1995). De plus, bien que cette phosphatase soit significativement moins exprimée chez l'adulte, son association avec les microtubules est augmentée dans le cerveau adulte de rat (Dudek and Johnson, 1995). Elle est impliquée dans la déphosphorylation des protéines tau au niveau de différents sites: Ser46, 199,202,396 et 404 (Gong et al., 1994; Ono et al., 1995).

III- 5- 3- 3 Protéine phosphatase 2B ou PP2B

Cette protéine phosphatase, encore appelée calcineurine, se trouve de manière prédominante dans le tissu nerveux. Comme pour la PP2A, il existe plusieurs isoformes de la sous-unité catalytique conduisant à plusieurs formes de la PP2B (Walter and Mumby, 1993). Cette PP2B, dépendante du calcium et de la calmoduline, peut être inhibée par des agents chélateurs du calcium, comme l'EGTA, ainsi que par des toxines comme la cyclosporine A ou l'acide okadaïque (à concentration élevée 5µM) (Walter and Mumby, 1993). L'expression et l'association aux microtubules de cette PP2B augmentent au cours de la vie et demeurent élevées au stade adulte (Dudek et Johnson, 1995). C'est en déphosphorylant les protéines microtubulaires tau et MAP2 que la calcineurine jouerait un rôle important au niveau des fonctions des microtubules (Goto et al., 1985). En augmentant la concentration du calcium intracellulaire dans des cellules nerveuses, Fleming et Johnson constataient la déphosphorylation des protéines tau. Cette déphosphorylation était inhibée par la cyclosporine A, impliquant spécifiquement l'activité phosphatasique de la PP2B (Fleming et Johnson, 1995). Cette protéine phosphatase est impliquée dans la déphosphorylation des protéines tau au niveau des résidus Ser46, 199, 202, 235, 396 et 404.

L'état de phosphorylation des protéines tau résulte des activités conjointes des protéines kinases et phosphatases présentes dans les cellules.

Les protéines phosphatases 2A et 2B sont capables de déphosphoryler directement les protéines tau sur différents sites. La PP2A déphosphoryle efficacement, in vitro , les protéines tau préalablement phosphorylées par différentes protéines kinases (Goedert et al., 1995), sur des sites communs ou non à ceux déphosphorylés par la PP2B (Ono et al., 1995). Cette déphosphorylation est également observée dans des cellules ou des tranches de cerveau, où l'activité spécifique de la PP2A ou de la PP2B est analysée grâce à l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de ces deux PP (Saito et al., 1995; Merrick et al., 1996). Ces inhibiteurs pourraient agir directement sur les protéines phosphatases, en induisant une déméthylation ou même une protéolyse de la protéine phosphatase (Favre et al., 1997). De plus, l'absence de la calcineurine A alpha dans le cerveau de souris (souris dépourvues du gène codant pour cette PP) entraîne une hyperphosphorylation des protéines tau, spécialement au niveau des résidus Ser396/404 (Kayali et al., 1997). L'activité des protéines phosphatases sur la phosphorylation des protéines tau pourrait être également indirecte. En effet, cette activité pourrait s'exercer sur les protéines kinases dont l'activité est également régulée par leur état de phosphorylation. Ainsi, la PP2A purifiée déphosphoryle la protéine kinase capable de s'autophosphoryler, la CaMK II, et la sous unité a de la phosphorylase kinase (Lai et al., 1986; Barnes et al., 1995). Le traitement de tranches de cerveaux de rats, par les facteurs de croissance acide ou basique des fibroblastes, est capable de restaurer une partie de la phosphorylation des protéines tau au site AT8, comme peut le faire le traitement de ces cellules par l'acide okadaïque à 1 µM (Burack et Halpain, 1996). Ces résultats suggèrent que la phosphorylation des protéines tau par ces traitements serait médiée par l'activation de certaines protéines kinases.

Comme leur expression, l'état de phosphorylation des protéines tau est régulé au cours du développement. Ainsi, les protéines tau, issues de cerveau de fœtus, sont plus hautement phosphorylées que les protéines tau exprimées dans le cerveau adulte, et l'étendue de cette phosphorylation résulte d'activités phosphatasiques plus ou moins importantes à ces différents stades du développement (Mawal-Dewan et al., 1994; Rösner et al., 1995). En effet, l'étude de la régulation de la phosphorylation au cours du développement montre que la transition des isoformes des protéines tau fœtales en protéines tau adultes (10 à 15 jours après la naissance chez le rat) coïncide avec une augmentation de l'activité phosphatasique, elle-même, concomittante à une diminution de l'activité kinasique (Mawal-Dewan et al., 1994; Rösner et al., 1995). De plus, certains sites semblent préférentiellement déphosphorylés chez l'adulte.

Les Ser396 et 404 phosphorylées sont reconnues par les anticorps monoclonaux AD2 (Buée-Scherrer et al., 1996) et PHF-1 (Greenberg et al., 1992). Ces résidus sont naturellement phosphorylés dans une lignée cellulaire de neuroblastomes humains, les SKNSH-SY 5Y (Martin et al., 1995). Cette phosphorylation est abondante, durant les premiers stades de différenciation induite par l'acide rétinoïque, puis diminue fortement dans des stades plus tardifs de différenciation (Martin et al., 1995). Cette diminution de phosphorylation est similaire à celle observée, in vivo, durant le développement axonal (Pope et al., 1993), ou au niveau du développement d’extensions neuritiques dans les cellules SY 5Y (Pope et al., 1994). La phosphorylation de ces protéines peut être modulée par la transduction de signaux extracellulaires. En effet, lorsque ces cellules en culture sont traitées par la fibronectine ou la laminine, deux protéines présentes naturellement dans la matrice extracellulaire, cette phosphorylation est favorisée. (Martin et al., 1995). Cette induction pourrait être médiée par les intégrines, dont la sous-unité ß1 est exprimée par les SKNSH-SY 5Y (Rossino et al., 1991), et dont l'implication comme récepteur membranaire dans l'initiation de signaux de transduction a été établie (Guan et al., 1991; Hynes, 1987,1992). De plus, l'adhésion cellulaire, médiée par les intégrines, pourrait entraîner la stimulation et la translocation vers le noyau de MAP kinases (Chen et al., 1994). La capacité de ces protéines kinases à phosphoryler les protéines tau a été largement montrée dans des expériences de phosphorylation réalisées in vitro, suggérant que cette activité kinasique pourrait être responsable ou participer à l'augmentation de l'immunomarquage des protéines tau par l'anticorps PHF-1. D'autres récepteurs membranaires, comme les récepteurs muscariniques à l'acéthylcholine de type (m)1, pourraient également contrôler la phosphorylation des protéines tau. En effet, la stimulation de ces récepteurs exprimés après transfection par les cellules de phéochromocytome de rat, les PC12, conduit à une déphosphorylation des protéines tau (Sadot et al., 1996b). Cette stimulation pourrait agir, en synergie, avec le Nerve Growth Factor (NGF), sur la phosphorylation des protéines tau. La régulation de la phosphorylation des protéines tau pourrait donc médier les informations provenant du système cholinergique jusqu'au cytosquelette (Sadot et al., 1996b).

D'autres agents ou stress, comme les chocs thermiques, pourraient également induire des modifications de la phosphorylation des protéines tau (Papasozomenos, 1996).Ainsi, le traitement des cellules PC12 par choc thermique conduit à l'augmentation de la phosphorylation des protéines tau (Wallace et al., 1993) Ainsi l'incubation, à 34 °C, de tranches de cerveaux de rats nouveau-nés, entraîne une déphosphorylation rapide des protéines tau aux sites reconnus par les anticorps Tau-1 et AT8,tandis que d'autres sites sont plus résistants, comme le site PHF-1 (Burack et Halpain, 1996). Une augmentation de la température conduit également à une déphosphorylation, révélée par une augmentation du marquage par l'anticorps Tau-1. Cette diminution du degré de phosphorylation des protéines tau est réversible (Papasozomenos et Su, 1995).

Les protéines tau sont donc retrouvées phosphorylées, in vivo, et cette phosphorylation a été décrite comme diminuant leur capacité à assembler les microtubules in vitro (Lindwall and Cole, 1984b). Au cours du cycle cellulaire, la phosphorylation des protéines tau varie. En interphase, la majorité des protéines tau, peu phosphorylées, sont trouvées associées avec les microtubules afin de maintenir l'architecture cellulaire. Par contre, au cours de la division cellulaire, la phosphorylation des protéines tau augmente (Pope et al., 1994). Dans les cellules CHO transfectées par une isoforme des protéines tau, cette phosphorylation provoque la dissociation des protéines tau des microtubules, qui peuvent alors se réorganiser pour former le fuseau mitotique (Preuss et al.,1995).

L'implication de la phosphorylation sur la conformation des protéines tau est visible après migration des protéines sur un gel SDS-PAGE. Sur un tel gel, les protéines tau déphosphorylées migrent plus rapidement que les mêmes espèces phosphorylées (Lindwall and Cole, 1984a,b). De même, après phosphorylation, les protéines tau recombinantes migrent moins rapidement (Gustke et al., 1992; Lichtenberg-Kraag et al., 1992; Mulot et al., 1994).

La phosphorylation pourrait avoir un rôle protecteur vis à vis d'une dégradation enzymatique. En effet, la phosphorylation des protéines tau par la PKA diminue sa dégradation par la calpaine (Litersky and Johnson, 1992). Cette calpaine est une protéase, activée par le calcium, trouvée en forte concentration dans le cerveau (Perlmutter et al., 1990). Néanmoins, les isoformes fœtales différemment phosphorylées sont efficacement dégradées par la m-calpaine, présente dans le cerveau (Mercken et al., 1995).

A l'heure actuelle, il semble plus probable que, seule, la phosphorylation de certains sites interviendrait dans la capacité des protéines tau à se lier aux microtubules, ainsi que sa capacité à les polymériser.

La majorité des sites phosphorylables sur les protéines tau in vivo sont répartis de part et d'autres des regions répétitives. Leur phosphorylation in vitro par cdk-5 ou MAP Kinase diminue d'environ 20% l'interaction tau-tubuline, en entraînant des variations conformationnelles des protéines tau (Biernat et al., 1993; Brandt et Lee, 1993; Trinczek et al., 1995). La phosphorylation semble avoir le même effet sur les protéines tau vis-à-vis de la polymérisation des microtubules dans différentes lignées cellulaires transfectées par les protéines tau (Bramblett et al., 1993; Haque et al., 1995; Medina et al., 1995). L'inhibition n'est donc que partielle.

Par contre, la phosphorylation des Ser262, Ser356 et, à un moindre niveau, celle des Ser293 et Ser324, localisées dans les régions impliquées dans la liaison aux microtubules, pourraient diminuer très fortement (Seubert et al., 1995) voire même empêcher la liaison de tau aux microtubules (Biernat et al., 1993; Drewes et al., 1995; Trinczek et al., 1995). La Ser262 semble de plus grand intérêt puisque c'est la seule de ces quatre Ser a être effectivement trouvée phosphorylée sur les protéines tau in vivo (Morishina-Kawashima et al., 1995). De plus, la phosphorylation de ce résidu semble être augmentée chez les patients Alzheimer (Hasegawa et al., 1992; Gross et al., 1994).

La phosphorylation de la Thr231 semble intervenir dans la régulation de l'activité de nucléation des protéines tau (Wang et al., 1996).

III- 6- Les autres modifications post-traductionnelles

Il existe des modifications post-traductionnelles autres que la phosphorylation, comme la déamidation (Montejo de Garcini et al., 1986) et la N-méthylation des résidus de lysine (Wischik et al., 1988). Les protéines tau commencent toutes par un résidu alanyl acétylé, et non par une méthionine (Hasegawa et al., 1992).

La O-glycosylation, caractérisée par l'addition d'un résidu N-acétyl glucosamine sur le groupement hydroxyle d'une sérine et/ou d'une thréonine, pourrait avoir des fonctions modulatrices similaires à la phosphorylation (Holt et al., 1987; Kearse et al., 1991; Haltiwanger et al., 1992). Cette modification post-traductionnelle a été rapportée sur des résidus des protéines tau purifiées à partir de cerveau de boeuf ( Arnold et al., 1996).

III- 7- Localisation des protéines tau

III- 7- 1- 1- Protéines tau sont principalement localisées dans l'axone

La morphologie des neurones est caractérisée par une structure polarisée avec un compartiment axonal et un compartiment somato-dendritique. La distribution des protéines tau et MAP2 dans ces compartiments est caractéristique et pourrait jouer un rôle dans l'établissement et le maintien de la polarité neuronale (Matus et al., 1981, 1994; Binder et al., 1985, 1986; Peng et al., 1986). In situ, les protéines tau sont majoritairement retrouvées dans l'axone tandis que MAP2 est localisée dans le soma et les dendrites (Bernhardt et Matus, 1984; De Camilli et al., 1984; Binder et al., 1985; Kowall et Kosik, 1987; Brion et al., 1988; Trojanowski et al., 1989). Parmi les mécanismes connus impliqués dans la compartimentation de ces MAPs, la localisation différentielle de leur ARNm semble intervenir. Garner et collaborateurs (1988) localisaient, par hybridation in situ, les ARNm codant pour MAP2. Plus récemment, dans des neurones différenciés, l'ARNm de tau est retrouvé concentré dans le corps cellulaire et la partie proximale de l'axone (Litman et al., 1993) représentant peut-être une première étape dans l'acheminement de cet ARNm dans une région plus distale de l'axone. Dans les cellules neuronales, les microtubules pourraient participer au transport axoplasmique des ARNm de tau, comme ils le font pour des vésicules ou des organites (Okabe et Hirokowa, 1989; Litman et al., 1994). Des protéines spécifiques pourraient reconnaître certaines séquences, localisées dans la région 3'UTR des ARNm de tau, et agir, en tant que molécules chaperonnes, pour acheminer le transcrit jusqu'au site de traduction dans l'axone (Behar et al., 1995). En plus de la localisation des ARNm, la compartimentation de ces MAPs peut également se produire par un taux de renouvellement différentiel local puisqu'après micro-injection dans les axones et les dendrites, les protéines tau demeureraient dans les axones alors que MAP2 se retrouvait dans le corps cellulaire et les dendrites (Hirokawa et al., 1996). La structure des MAPs semble également participer à leur localisation sélective. En effet, les protéines MAP2 pourraient être empêchées, par structure de leur domaine N-terminal, d'entrer dans l'axone, les confinant donc au niveau du soma et des dendrites (Kanai et Hirokawa, 1995).

Par leur extrémité N-terminale, les protéines tau seraient liées à des composants de la face cytosolique de la membrane plasmique des PC12, différenciées ou non. Cette association semble importante pour le développement de neurites, mais elle établirait aussi un rôle pour les protéines tau dans la médiation des interactions entre microtubules et membrane plasmique. De plus, leur structure primaire semble également leur conférer une liaison préférentielle pour les microtubules axonaux, dans le cas des protéines tau, ou pour les microtubules dendritiques ou présents dans le corps cellulaire pour MAP2 (Kanai et Hirokawa, 1995). Cette liaison des protéines tau aux microtubules axonaux a été impliquée dans le développement de la polarité neuronale. Leur répartition le long de l'axone semble significativement différente de la distribution des microtubules axonaux. En effet, tandis que les microtubules axonaux sont retrouvés plus fortement concentrés au niveau de l'axone proximal, la concentration en protéines augmente, quant à elle, vers l'axone distal avec le pic de concentration au niveau de la transition axone-cône de croissance (Kempf et al., 1996) mais, aussi, au niveau du cône de croissance développé par des neurones primaires d'hippocampe de rat (Brandt et al., 1995).

Bien que la fraction majoritaire des protéines tau cellulaires se situent dans le cytoplasme, Greenwood et Johnson ont montré la présence de protéines tau dans le noyau, et, plus particulièrement, au niveau du nucléole de cellules de neuroblastomes, les cellules LA-N-5 (Greenwood et Johnson, 1995). Les protéines cytosoliques et nucléaires sont approximativement phosphorylées à un degré similaire. Le transport des protéines tau du cytoplasme vers le noyau n'a pas encore été décrit mais ces protéines tau seraient phosphorylées dans le cytoplasme avant son transport vers le noyau (Greenwood et Johnson, 1995).

III- 7- 1- 2- La phosphorylation intervient dans la compartimentation des protéines tau

La localisation des protéines tau humaines est principalement axonale, mais des formes phosphorylées peuvent également être rencontrées au niveau du compartiment somato-dendritique (Papasozomenos et Binder, 1987; Delacourte et al., 1990). En effet, le marquage intense des axones par l'anticorps Tau-1, un anticorps reconnaissant les protéines tau lorsqu'elles sont déphosphorylées dans une région s'étendant des résidus 189 à 207,(Szendrei et al., 1993), suggérait une compartimentation axonale des protéines tau (Binder et al., 1985; Papasozomenos et Binder, 1987). Cependant, lorsque le tissu était préalablement traité par la phosphatase alcaline, le corps cellulaire et les dendrites étaient également marqués par Tau-1 (Papasozomenos et Binder, 1987; Riederer et Binder, 1994). La localisation cellulaire des protéines tau dépendrait du degré de phosphorylation. Cette répartition, à la fois dans les prolongements cellulaires et le soma, a également été observée dans des fibroblastes transfectés par tau (Lo et al., 1993). La phosphorylation des protéines tau pourrait également agir sur l'axogénèse qui a été particulièrement étudiée au niveau des cultures de neurones hippocampiques. Ainsi, lors des premiers stades, les protéines tau sont retrouvées dans le corps cellulaire mais également dans tous les neurites. Néanmoins, la phosphorylation au niveau du site Tau-1 est plus faible au niveau de l'axone naissant qu'au niveau des prolongements plus petits, précurseurs des neurites, ou du corps cellulaire (Mandell et Banker, 1996). Au cours de l'élongation de l'axone, un gradient de phosphorylation proximo-distal est établi, avec une phosphorylation au site Tau-1 plus importante à la base de l'axone qu'au niveau du cône de croissance. L'estimation réalisée par Mandell et Banker (1996) propose une répartition de 80% des protéines tau phosphorylées au site Tau-1 réparties dans le soma, les prolongements mineurs et l'axone proximal et de seulement 20% de ces protéines tau phosphorylées dans l'axone distal et le cône de croissance. Cette répartition est également observée au niveau d'une culture primaire de neurones de moëlle épinière (Kanai et Hirokawa, 1995). La modulation de ce gradient de phosphorylation par des signaux transmembranaires pourrait diriger l'établissement de la polarité neuronale.

Les protéines tau peuvent être exprimées dans les cellules gliales, principalement au cours de maladies dégénératives (Yamazaki et al., 1995; Chin et Goldman, 1996). Les protéines tau ont été mise en évidence dans des oligodendrocytes au niveau du cerveau de rat, mais également dans des oligodendrocytes en culture provenant d'agneau. Leur localisation est différente. En effet, les protéines tau ne sont trouvées que dans le soma chez le rat. Par contre, les prolongements cellulaires et les structures ressemblant aux cônes de croissance sont marqués en plus dans les cultures d'oligodendrocytes d'agneau (Lopresti et al., 1995).

Les transcrits tau ont été, comme les protéines, détectés dans différents tissus, tels que le coeur, le muscle, le foie, les testicules (Ashman et al., 1992; Gu et al., 1996; Oyama et al., 1996), ou les fibroblastes (Ingelson and Lannfelt, 1996).

III- 8- Protéines tau et Maladie d'Alzheimer

III- 8- 1- 1- Ultra-Structure des PHFs

Dans la maladie d'Alzheimer, les enchevêtrements neurofibrillaires sont retrouvés dans les corps cellulaires, dans les dendrites sous la forme de fibres incurvées, et dans les neurites anormaux associés avec la plaques séniles. Ces enchevêtrements neurofibrillaires sont également retrouvés au cours du vieillissement normal mais l'étendue de ces anomalies est réduite à la région hippocampique (Bouras et al., 1994). Le principal composant de ces 3 lésions neurofibrillaires est une structure inhabituelle au niveau du cytosquelette: les paires de filaments appariés en hélice (PHFs) (Kidd, 1963, 1964), mais on trouve également des filaments droits (Crowther, 1991). Le développement de techniques d'extraction a favorisé les études ultrastructurales de ces PHFs. Différentes études ont ainsi proposé une représentation shématique de la struture fine de ces PHFs. Selon Wischik et collaborateurs, les PHFs résulteraient de l'assemblage de deux rubans hélicoïdaux qui présenteraient une périodicité d'environ d'environ 80 nm et un diamètre variant de 8 à 20 nm (Wischik et al., 1985). Pour Wen et Wisniewski, l'hélice est formée de protofilaments unis par des ponts tandis que Miyakawa proposait l'assimilation des PHFs à des tubules torsadés formés de 8 protofilaments hélicoïdaux (Wen et Wisniewski, 1987; Miyakawa, 1989). Plus récemment, Ikonomovic et collaborateurs proposaient que chaque sous-unité structurale des PHFs était constituée d'au moins 4 protofilaments identiques (Ikonomovic et al., 1995).

Les PHFs peuvent être isolées soit sous la forme de fragments enchevêtrés (Kondo et al., 1988; Wischik et al., 1988b), soit sous la forme de filaments dispersés (Greenberg et Davies, 1990; lee et al., 1991). Ces deux types de PHFs présentent des séquences communes, mais diffèrent dans leurs propriétés. En effet, tandis que la plupart des PHFs, sous la forme de filaments dispersés, sont solubles en guanidine ou en SDS, la plupart des PHFs, sous la forme de fragments enchevêtrés, sont insolubles dans ces réactifs. De plus, ils présentent une sensibilité différente aux protéases. Le traitement par la pronase de préparations d'enchevêtrements libère le contour des PHFs mais ne dégrade pas le "cœur", le centre de ces PHFs. Par contre, les PHFs, sous la forme de filaments dispersés, sont complètement dégradés lorsqu'ils subissent le même traitement (Goedert et al., 1992c) (FIGURE 15).

III- 8- 1- 2- Agencement des tau au sein des PHFs

De nombreuses études biochimiques ont rapporté que les protéines tau représentent un composant majeur de ces PHFs (Goedert et al., 1988; Wischik et al., 1988a,b; Kondo et al., 1988; Lee et al., 1991). Selon certains auteurs, les protéines tau formeraient un axe protéique résistant au sein des PHFs. La digestion des PHFs par la pronase ou la trypsine, ainsi que l'utilisation d'anticorps dirigés contre différentes régions de la molécule de tau, ont révélé que les parties amino- et carboxy-terminales de tau se trouvaient à l'extérieur, tandis que les régions répétitives formaient le cœur de la structure et étaient associées à de l'ubiquitine, élément important dans le système de dégradation des protéines cytosoliques dépendant de l'ATP (FIGURE 15) (Mori et al., 1987; Wischik et al., 1988a,b; Kondo et al., 1988; Goedert et al., 1992c). L'extrémité carboxy-terminale est beaucoup moins sensible que l'extrémité amino-terminale à l'activité protéasique. En effet, la région des domaines répétés dans la moitié carboxy-terminale formant l'axe des PHFs sont donc beaucoup moins accessibles aux protéases que les extrémités amino-terminales, plus éloignées de l'axe (Jakes et al., 1991). Que les isoformes aient 3 ou 4 séquences répétitives, c'est toujours une zone d'une longueur égale à 3 séquences répétitives qui est protégée des dégradations (Jakes et al., 1991). Ces résultats suggèrent donc que les protéines tau pourraient s'associer entre elles par leur domaine de liaison aux microtubules et ainsi conduire à la formation de PHFs.

Une classe de PHFs, isolée sous la forme de filaments dispersés et solubles en SDS, est constituée de protéines tau complètes et hyperphosphorylées; ces protéines ont été appelées protéines tau-PHF ou A68 (Greenberg et Davies, 1990; lee et al.,1991). De telles structures représenteraient les premiers stades de formation de PHFs. Ainsi, ces tau-PHF s'accumuleraient sous forme de PHFs, subiraient un clivage au niveau de sa moitié amino-terminale qui serait suivi d'une ubiquitination (Morishima-Kawashima et al., 1993).

  FIGURE 15: Agencement des protéines tau au sein des PHFs.  

III- 8- 1- 3- Présence de tels enchevêtrements dans d'autres démences

Une des caractéristiques principales d'un grand nombre de maladies neurodégénératives est la présence d'enchevêtrements neurofibrillaires au niveau des neurones. L'analyse par la microscopie électronique permet d'analyser la structure des enchevêtrements et de différencier les maladies en deux catégories: celles dont les enchevêtrements sont constitués de filaments droits, comme la dégénérescence cortico basale ou la paralysie supranucléaire progressive, et celles dont ces enchevêtrements sont faits de PHFs (pour revue, voir Delacourte et Buée, 1997). Néanmoins, les pathologies se distinguent également par une distribution différente de la dégénérescence neurofibrillaire dans les couches et les aires du cerveau (Hof and Morrison, 1994).

En 1994, Matsuo et collaborateurs montraient que la phosphorylation des tau-PHF ne semblait pas anormale puisque la plupart des sites supposés anormalement phosphorylés sur les protéines étaient également retrouvés sur les protéines tau provenant de biopsies de tissu cérébral normal adulte. Ce matériel se différenciait des préparations préalablement étudiées par un délai post-mortem court (Matsuo et al., 1994). La phosphorylation apparemment plus faible des protéines tau provenant de tissu cérébral normal autopsique résultait des activités phosphatasiques endogènes restées très actives durant le délai post-mortem (Matsuo et al., 1994; Mawal-Dewan et al., 1994; Buée-Scherrer et al., 1996).

Par contre, quelle que soit la durée du délai post-mortem, les protéines tau-PHF demeuraient hyperphosphorylées, suggérant qu'une diminution ou une dérégulation des activités phosphatasiques dans le cerveau de patients pourrait contribuer à cette hyperphosphorylation des protéines tau (Matsuo et al., 1994; Iqbal et al., 1994b).

Les protéines tau extraites de ces PHF, appelées PHF-tau, présentent une mobilité ralentie en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et un point isoélectrique, compris entre 5,5 et 6,5, plus acide que celui des protéines tau autopsiques (Flament et al., 1989; Ksiezak-Reding et al., 1992). La migration en gel SDS-PAGE de ces protéines tau-PHF montrent que les bandes sont également accompagnées d'une traînée qui vraissemblablement représente le matériel insoluble dans le SDS des PHF. Cette traînée est différemment reconnue par les anticorps dépendants de la phosphorylation (Sergeant et al., 1997). La caractérisation biochimique de ces tau-PHF par la technique des immunoempreintes, révéla la présence d'un triplet de protéines, t55, t64 et t69 (selon leur poids moléculaire apparent), également appelées A68 ou tau-PHF, uniquement dans les homogénats de cerveaux de patients atteints de la MA et pas dans les homogénats de cerveaux de témoins autopsiés (Flament et al., 1989; Flament et Delacourte, 1989; Delacourte et al., 1990; Greenberg et Davies, 1990; Ksiezak-Reding et al., 1990; Lee et al., 1991; Greenberg et al., 1992). Plus récemment, une bande de plus haut poids moléculaire, appelée t74, a également été décrite (Delacourte et al., 1996; Sergeant et al., 1997). Plusieurs équipes ont montré qu'une phosphorylation de ces protéines était responsable de ces modifications (Grundke-Iqbal et al., 1986b; Flament et al., 1989; Delacourte et al., 1990; Lee et al., 1991; Goedert et al., 1992c).

III- 8- 2- 2- Correspondance entre les bandes du triplet et les six isoformes des protéines tau

Selon Goedert et collaborateurs (1992c), chaque bande du triplet de tau-PHF résulterait de l'hyperphosphorylation de deux isoformes des protéines tau; la bande appelée t55 corespondrait aux isoformes 2-3-10- et 2-3-10+ hyperphosphorylés, la bande t64 aux isoformes 2+3-10- et 2+3-10+ et la bande t69 aux isoformes 2+3+10- et 2+3+10+.(Goedert et al., 1992c). Plus récemment, Mulot et collaborateurs proposaient que l'addition d'un insert du côté amino- ou carboxy-terminal conduisait à une augmentation du poids moléculaire prenant ainsi en compte l'existence de la bande de 74 kDa (Mulot et al., 1994). Selon leurs résultats, la bande t55 correspondrait à l'isoforme la plus courte (2-3-10-) hyperphosphorylée, t64 aux isoformes avec un seul insert (2+3-10- et 2-3-10+), t69 aux isoformes avec deux inserts (2+3-10+, 2+3+10-) et enfin t74 à l'isoforme la plus longue (2+3+10+).

III- 8- 2- 3- Altération des fonctions des protéines tau-PHF

Ces protéines tau-PHF sont également caractérisées par la perte de leur capacité à se lier aux microtubules (Iqbal et al., 1986). L'hyperphosphorylation des tau-PHF et leur incapacité à se lier aux microtubules sont restaurées après déphosphorylation. En effet, après déphosphorylation, les tau-PHF migrent au même niveau que les protéines tau extraites de cerveaux adultes témoins autopsiés, suggérant que les protéines tau-PHF sont hyperphosphorylées (Goedert et al.,1992c; Gong et al., 1994). De la même manière, la déphosphorylation de ces tau-PHF restaure leur capacité à se lier aux microtubules (Bramblett et al., 1993; Iqbal et al., 1994; Wang et al., 1995, 1996).

L'hyperphosphorylation des protéines tau modifierait leur conformation, conduisant à la perte de leur liaison aux microtubules ainsi qu'à leur accumulation sous forme de PHF. L'accumulation des protéines tau agrégées destabiliserait les microtubules et perturberait ainsi le transport axonal, conduisant à la dégénérescence du neurone. C'est pourquoi de nombreuses équipes ont cherché à élucider la nature de cette phosphorylation.

III- 8- 2- 4- Analyse des sites phosphorylés sur les protéines tau-PHF

La spectrométrie de masse et le séquençage peptidique (Watanabe et al., 1993; Morishima-Kawashimo et al., 1995), ainsi que l'utilisation de sondes immunologiques dépendantes de la phosphorylation (FIGURE 13, Tableau II) (pour revue, Lee et al., 1995), ont permis d'identifier les sites phosphorylés, in vivo, sur ces protéines tau-PHF. Les numéros d'acides aminés, utilisés pour décrire les différents sites de phosphorylation, correspondent à la numérotation de l'isoforme la plus longue des protéines tau humaines. Au total, 19 sites de phosphorylation ont été décrits par spectrométrie de masse (Morishima-Kawashima et al., 1995): Ser 198, 199, 202, 208, 210, Thr 212, Ser 214, Thr 217, 231, Ser 235, 262, 396, 400, 403, 404, 412, 413 et 422. Cinq autres sites ont été également décrits comme étant phosphorylés sur les protéines tau-PHF dans d'autres études: Ser 46, Thr 123, Ser 137, Thr 181, Thr 205 (Crowther et al., 1994; Brion et al., 1991; Hasegawa et al., 1993; Woodgett et al., 1990; Goedert et al., 1994,1995) (FIGURE 16).

Sur ces 21 sites, seulement 12 sont de type Ser/Thr-Pro. De plus, excepté la Ser 262, tous ces sites de phosphorylation sont localisés en dehors des domaines de liaison aux microtubules et sont concentrés pour la plupart dans deux régions, s'étendant des résidus 181 à 235 et des résidus 396 à 422.

Les protéines tau-PHF sont-elles phosphorylées anormalement ou hyperphosphorylées sur certains résidus?

Une phosphorylation anormale de site signifie que certains résidus sont trouvés phosphorylés sur les tau-PHF et non sur les protéines tau extraites de tissu cérébral normal. Une hyperphosphorylation signifie que, pour un site donné, une plus grande proportion de molécules de tau-PHF soit trouvée phosphorylées que les protéines tau normales.

Bien que 14 de ces sites soient également trouvés phosphorylés sur les protéines tau fœtales, les protéines tau-PHF demeurent, comparées aux protéines tau normales biopsiques, à la fois anormalement phosphorylées et hyperphosphorylées. En effet, les nombreux anticorps dépendants de la phosphorylation détectent de manière plus forte les protéines tau-PHF que les protéines tau issues de tissu cérébral fœtal ou adulte biopsique