LA MORT NEURONALE

par le Dr Françoise Esclaire, Service d'Histologie, CHU de Limoges

I - LES DEUX PRINCIPAUX PROCESSUS DE MORT CELLULAIRE : L'APOPTOSE ET LA NECROSE

Quels que soient le type cellulaire et les méthodes d'étude utilisées, on définit classiquement deux principaux processus de mort cellulaire : l'apoptose et la nécrose (Majno et al, 1960 ; Kerr et al, 1972 ; Wyllie et al, 1980 ; Clarke, 1990 ; Cohen et Duke, 1992 ; Buja et al, 1993). Ces deux processus se caractérisent par des circonstances de survenue, des modifications morphologiques et des mécanismes moléculaires distincts.

- L'APOPTOSE

1) Circonstances de survenue

L'apoptose est un processus de mort cellulaire programmée se produisant normalement au cours du développement embryonnaire dans les différents tissus de l'organisme. Ce processus de mort cellulaire programmée intervient aussi chez l'organisme adulte où il permet de limiter la taille des populations cellulaires et d'éliminer certaines cellules indésirables.

Contrairement à la nécrose, l'apoptose affecte généralement des cellules dispersées au sein du tissu et elle ne s'accompagne pas d'une réaction inflammatoire.

En outre, il devient de plus en plus évident qu'un dérèglement de l'apoptose ou de son contrôle pourrait être impliqué dans de nombreuses pathologies humaines. D'une part, le blocage de l'apoptose peut aboutir à la prolifération incontrôlée d'une population cellulaire et pourrait jouer un rôle fondamental à différentes étapes de la carcinogenèse (Carson et Ribeiro, 1993 ; Thompson, 1995). D'autre part, une stimulation anormale de l'apoptose peut conduire à une perte cellulaire et pourrait être impliquée dans certaines maladies neurodégénératives caractérisées par une mort neuronale massive ou dans le SIDA caractérisé par l'élimination des lymphocytes T4 (Carson et Ribeiro, 1993).

2) Caractéristiques morphologiques

A l'inverse de la nécrose, la perte de l'intégrité membranaire et l'altération des organites cellulaires ne sont pas des événements précoces de l'apoptose. Une des premières modifications morphologiques dues à l'apoptose est la réduction du volume cellulaire : le cytoplasme devient très condensé avec des organites cellulaires morphologiquement intacts (Cohen, 1993). Au cours de cette étape, la cellule perd ses contacts avec les cellules voisines. Des modifications membranaires sans traduction morphologique se produisent : la phosphatidyl-sérine (normalement présente sur la face interne de la membrane plasmique) est transloquée sur la face externe de la bicouche phospholipidique. Au cours de la réduction du volume cellulaire, les transglutaminases cellulaires sont activées : elles entraînent la formation de "liaisons croisées" entre les protéines et sont responsables de la formation d'une structure rigide des protéines "transglutaminées" dans le cytoplasme de la cellule apoptotique (Fesus et al, 1987). Le noyau subit lui aussi une réduction de volume : rapidement la chromatine se condense puis se fragmente en petits lobes entourés par la membrane nucléaire (Earnshaw, 1995). Ces modifications nucléaires s'accompagnent d'une activation des endonucléases calcium-dépendantes responsable du clivage de l'ADN au niveau des régions internucléosomales. Cette fragmentation de l'ADN n'a pas de traduction morphologique mais elle confère un profil de migration électrophorétique particulier à l'ADN : les fragments d'ADN (qui sont des multiples de 180-200 paires de bases correspondant aux nucléosomes) séparés sur gel d'agarose présentent une migration en échelle caractéristique de l'apoptose ("DNA ladders"), à l'inverse de la migration diffuse observée dans la nécrose.

Après cette phase de condensation cytoplasmique et nucléaire, la cellule se fragmente : il se forme des protubérances membranaires qui vont se séparer de la cellule pour former les "corps apoptotiques", entourés par la membrane plasmique. In vivo, les corps apoptotiques sont rapidement phagocytés par les cellules adjacentes ou par les macrophages. La présence de phosphatidylsérine sur la face externe de la membrane plasmique est probablement impliquée dans la reconnaissance des corps apoptotiques par les cellules phagocytaires.

La conservation de l'intégrité membranaire des corps apoptotiques et leur élimination rapide par phagocytose permettent d'éviter le relargage du contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire : ainsi, la mort de la cellule par apoptose ne déclenche pas de réaction inflammatoire (Lo et al, 1995).

Il est à noter que cette élimination rapide des corps apoptotiques par phagocytose est limitée dans les modèles expérimentaux d'apoptose in vitro : en l'absence d'un nombre suffisant de cellules phagocytaires, la phase ultime de l'apoptose se traduit par une cytolyse qualifiée de "nécrose secondaire".

3) Mécanismes moléculaires impliqués dans l'apoptose

L'apoptose est classiquement considérée comme une forme "active" de mort cellulaire souvent qualifiée de "suicide". Cette notion repose essentiellement sur le fait que la mort cellulaire par apoptose nécessite la synthèse de protéines (Wyllie et al, 1980). En effet, l'apoptose survenant au cours du développement ainsi que l'apoptose induite dans de nombreux types cellulaires in vitro peuvent être bloquées par des inhibiteurs de la synthèse des ARN et des protéines (Martin et al, 1988 ; Scott et Davies, 1990 ; Oppenheim et al, 1990 ; Schwartz et al, 1990).

Cependant, certains travaux démontrent que l'apoptose peut se produire en l'absence de synthèse protéique de novo. Par exemple, il a été démontré que de fortes doses de staurosporine, un inhibiteur des protéines kinases, pouvait provoquer l'apoptose de divers types cellulaires en présence d'un inhibiteur de la synthèse protéique (Weil et al, 1996). De façon encore plus surprenante, Jacobson et al (1994) ont démontré que dans des lignées fibroblastiques et oligodendrocytaires, des modifications morphologiques de type apoptotique pouvaient survenir en l'absence de noyau. Par ailleurs, il a été démontré que l'inhibition de la synthèse protéique pouvait déclencher l'apoptose dans certaines lignées cellulaires (Martin et al, 1990).

Actuellement, la plupart des auteurs s'accordent à penser que la machinerie de mort cellulaire existe de façon constitutive chez la plupart, voire toutes les cellules et que l'engagement ou non dans la voie du suicide dépendrait de l'équilibre entre les facteurs activateurs et les facteurs inhibiteurs de cette machinerie. Le déroulement de l'apoptose s'effectuerait en 2 phases :

- la phase de déclenchement ou d'engagement survenant en réponse à un signal intrinsèque ou extrinsèque, qui serait dépendante de la synthèse de ces facteurs,

- la phase d'exécution pendant laquelle se déroulerait la cascade enzymatique intracellulaire conduisant à la mort apoptotique effective et qui pourrait être indépendante de la synthèse protéique.

La survenue de l'apoptose en l'absence de synthèse protéique de novo pourrait ainsi s'expliquer par l'existence, dans certains types cellulaires ou dans certaines conditions environnementales, de facteurs répresseurs plus labiles que les facteurs activateurs.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'apoptose sont de mieux en mieux connus grâce aux nombreux travaux effectués au cours de la dernière décennie sur l'apoptose chez le nématode Caenorhabditis elegans d'une part, et dans le système immunitaire des Vertébrés d'autre part. Ces travaux ont pu mettre en évidence :

- des récepteurs membranaires impliqués dans le déclenchement du signal apoptotique

- des gènes responsables de la régulation de l'apoptose, dont l'induction peut activer ou inhiber la machinerie intracellulaire de l'apoptose

- des enzymes responsables de la phase d'exécution de l'apoptose, les caspases, dont l'activation conduit à la destruction de la cellule.

Enfin, il est à noter que des travaux très récents mettent en évidence un rôle déterminant pour les mitochondries dans le contrôle de l'apoptose. En effet, bien qu'apparaissant comme morphologiquement intactes au cours de l'apoptose, les mitochondries présenteraient un dysfonctionnement précoce qui constituerait une étape-clé dans la cascade apoptotique (Green et Reed, 1998).

a - Les récepteurs membranaires impliqués dans l'apoptose

La survie des cellules dépend étroitement de la présence de facteurs de croissance dans l'environnement cellulaire : lorsque ces signaux de survie sont présents, la machinerie apoptotique intracellulaire est maintenue inactive ; en l'absence des signaux nécessaires à la répression de l'apoptose, la cascade apoptotique intracellulaire est déclenchée, conduisant à l'activation des caspases.

Cette notion suggère l'implication des récepteurs des cytokines dans le contrôle de l'apoptose :

- Certains récepteurs sont capables de transmettre un signal apoptotique lorsqu'ils sont liés à leur ligand : il s'agit essentiellement de la famille du récepteur au TNF (tumor necrosis factor) dont le chef de file est le récepteur Fas (ou CD95 ou Apo1). Ces récepteurs possèdent un domaine cytoplasmique appelé "domaine de mort" (ou "death domain") directement impliqué dans l'activation de certaines caspases ; l'activation de ces caspases dites initiatrices par le "domaine de mort" des récepteurs de type Fas nécessite la présence d'un co-facteur ou protéine adaptatrice appelée FADD (Fas-associated death domain) (Ashkenazi et Dixit, 1998). L'activation de ces récepteurs est associée à des remaniements de la membrane plasmique, notamment l'hydrolyse de la sphingomyéline qui conduit à la libération intracytoplasmique de céramides (Cifone et al, 1994). La production de céramides participe à l'activation de la cascade apoptotique via l'induction du gène c-jun (Obeid et al, 1993 ; Rudin et Thompson, 1997).

- Certains récepteurs pourraient activer l'apoptose lorsqu'ils ne sont pas liés à leur ligand. C'est le cas de certains récepteurs aux facteurs de croissance comme le récepteur de basse affinité au NGF (ou récepteur p75) des neurones (Bergeron et Yuan, 1998).

b - Les gènes impliqués dans l'apoptose

L'idée selon laquelle toutes les cellules sont programmées pour mourir est soutenue par les études effectuées sur l'apoptose chez le nématode Caenorhabditis elegans : ces travaux ont permis d'identifier plusieurs gènes impliqués dans l'apoptose au cours du développement (Ellis et al, 1986, 1991 ; Hengartner et al, 1992 ; Hengartner et Horvitz, 1994).

Chez ce nématode, le nombre de cellules est précisément contrôlé : 1090 cellules somatiques sont produites durant la phase de prolifération et 131 meurent ensuite par apoptose. Les gènes impliqués dans cette mort apoptotique ont été nommés "ced" pour "cell death genes". Deux de ces gènes, ced-3 et ced-4, sont nécessaires à l'apoptose des 131 cellules : lorsqu'une mutation entraîne la perte de fonction de l'un ou l'autre de ces gènes, ces 131 cellules survivent. A l'inverse, le gène ced-9 inhibe le processus apoptotique : une mutation entraînant la perte de fonction de ce gène provoque une mort cellulaire massive alors qu'une mutation entraînant un gain de fonction de ced-9 provoque la survie des 131 cellules normalement destinées à mourir.

Chez les mammifères, des homologues de ces gènes "pro-apoptotiques" et "anti-apoptotiques" ont été identifiés ; les produits de ces gènes jouent un rôle fondamental dans le déroulement du processus apoptotique.

De plus, l'induction d'autres gènes est observée au cours de l'apoptose chez les mammifères. Il s'agit notamment de certains proto-oncogènes codant pour le facteur de transcription AP-1 et de certains gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire.

• Le gène homologue de ced-9 : bcl-2, et les gènes apparentés

L'homologue du gène anti-apoptotique ced-9 chez les mammifères est le gène bcl-2. A l'origine, ce gène a été identifié dans les lymphomes folliculaires humains où son expression est dérégulée par une translocation chromosomique : la surexpression de bcl-2 résultant de cette anomalie chromosomique protège les lymphocytes B de la mort par apoptose et conduit au développement néoplasique des follicules lymphoïdes (Cleary et Sklar, 1985).

D'autres homologues de ced-9 ont été clonés chez les mammifères. Ces gènes, qui constituent la "famille de bcl-2", interviennent dans la régulation de l'apoptose et peuvent être classés en deux groupes :

- les gènes "anti-apoptotiques" incluant bcl-2, bcl-x, bcl-w

- les gènes "pro-apoptotiques" incluant bax, bad, bak.

Les produits de ces gènes possèdent des domaines fonctionnels homologues et ont la capacité de former des homo- ou des hétérodimères avec bcl-2 ou bcl-x (Sato et al, 1994). Les protéines de la famille Bcl-2 sont des constituants de la membrane externe mitochondriale : elles formeraient des pores membranaires impliqués dans le maintien du potentiel transmembranaire mitochondrial (Vander Heinden et al, 1997 ; Minn et al, 1997).

Un certain nombre d'éléments conduisent à penser que bcl-2 exercerait son activité anti-apoptotique en s'opposant au relargage de certaines molécules contenues dans les mitochondries. En effet, il a été démontré que l'un des premiers événements se produisant dans les cellules soumises à un stress apoptotique est le relargage du cytochrome c des mitochondries (Kluck et al, 1997 ; Yang et al, 1997). Le cytochrome c ainsi relargué dans le cytoplasme serait impliqué dans l'activation des caspases qui caractérise la phase d'exécution de l'apoptose (Li et al, 1997 ; Hu et al, 1998). Or il a été démontré que dans les cellules protégées de l'apoptose par bcl-2, il existe un blocage du relargage du cytochrome c (Yang et al, 1997). Au contraire, la surexpression du gène bax provoque le relargage du cytochrome c et l'activation des caspases (Rossé et al, 1998).

Les mécanismes moléculaires régulant l'expression des gènes de la famille bcl-2 sont encore assez mal connus. Le gène p53, impliqué dans la régulation du cycle cellulaire mais aussi dans l'apoptose, semble participer à ces mécanismes : il interviendrait en réprimant l'expression de bcl-2 et en activant la transcription de bax (Miyashita et Reed, 1995).

• Le gène homologue de ced-4

Le gène ced-4 joue un rôle essentiel dans la mort cellulaire programmée chez C. elegans. Le produit de ce gène appelé CED-4 semble agir comme un catalyseur de CED-3 dans l'apoptose (Seshagiri et Miller, 1997 ; Chinnaiyan et al, 1997a,b). Chez les mammifères, une protéine homologue de CED4 vient d'être identifiée : cette protéine nommée Apaf-1 (pour "Apoptotic protease activating factor-1") est impliquée dans l'activation des caspases par le cytochrome c (Zou et al, 1997).

• Les gènes codant pour le facteur de transcription AP-1

Ces gènes c-fos et c-jun sont des proto-oncogènes appartenant à la famille des "immediate early genes" (IEG), gènes caractérisés par leur induction rapide et transitoire en réponse à diverses stimulations cellulaires. Les produits de ces gènes (dont les chefs de file sont respectivement les protéines c-Fos et c-Jun) sont des facteurs de régulation transcriptionnelle impliqués dans la régulation de l'expression de nombreux gènes : ces protéines se dimérisent pour former un complexe appelé AP-1 (pour "Activator Protein-1") qui se lie à l'ADN et active la transcription des gènes (Morgan et Curran, 1991).

L'induction de ces gènes est impliquée dans l'initiation du processus apoptotique dans de nombreux types cellulaires tels que les thymocytes (Grassilli et al, 1992), les cellules épithéliales (Marti et al, 1994), les cellules lymphoïdes (Collota et al, 1992), et les neurones (Estus et al, 1994) : ces études démontrent que l'induction de ces gènes (notamment c-jun) participe directement au processus apoptotique et est corrélée à la fragmentation de l'ADN dans les cellules. La surexpression de c-jun suffit à déclencher l'apoptose dans des lignées fibroblastiques ; le domaine fonctionnel d'activation transcriptionnelle de c-jun est nécessaire à cette activité pro-apoptotique (Bossy-Wetzel et al, 1997). L'activité pro-apoptotique de la protéine c-Jun nécessite aussi sa phosphorylation par des Jun-kinases ou JNK (pour "c-jun-N-terminal kinases") appartenant à la famille des MAP kinases (Mitogen Activated Protein Kinases) (Dickens et al, 1997).

• Les gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire

Certains gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire sont exprimés au cours de l'apoptose :

- l'oncogène c-myc est un puissant activateur de la prolifération cellulaire. Mais lorsque les cellules sont soumises à des conditions de culture restreignant la prolifération, comme la privation de sérum, ce gène induit l'apoptose (Evan et al, 1992). La surexpression de c-myc dans divers types cellulaires provoque une augmentation de l'apoptose ; l'apoptose ainsi induite implique l'activation de certaines caspases (Kangas et al, 1998).

- le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, est un bloqueur du cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994 ; Yonish-Rouach, 1996).

- la cycline D1, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, est indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996 ; Pardo et al, 1996).

Ces observations suggèrent que mitose et apoptose pourraient partager des mécanismes communs. Cette idée est soutenue par le fait que les cellules apoptotiques présentent un certain nombre de caractéristiques morphologiques communes avec les cellules mitotiques (condensation de la chromatine, désassemblage des lamines nucléaires, perte des contacts cellulaires). Chez les cellules post-mitotiques, l'apoptose pourrait correspondre à une tentative avortée de mitose (Batistatou et Green, 1993 ; Heintz, 1993 ; Rubin et al, 1993).

c - Les acteurs cytoplasmiques de l'apoptose : LES CASPASES

Chez le nématode C. elegans, deux des gènes ced ont un rôle pro-apoptotique au cours du développement : ced-3 et ced-4 (Ellis et Horvitz, 1986). Chez les mammifères, le gène homologue de ced-3 a été identifié : il code pour l'enzyme de conversion de l'interleukine-1ß (ICE) (Yuan et al, 1993 ; Nicholson et al, 1995). Cette enzyme est une cystéine protéase qui assure le clivage du précurseur de l'interleukine-1ß produisant la forme biologiquement active de cette cytokine.

L'intérêt suscité par cette enzyme, du fait de son implication dans l'apoptose, a conduit à identifier d'autres protéases de ce type : on connaît actuellement plus d'une dizaine de membres de cette famille de protéases appelées "caspases" pour "cysteine aspartate specific proteases" (Thorneberry et Lazebnik, 1998). Les caspases les mieux connues à ce jour sont la caspase 1 (ou ICE), la caspase 2 (ou Nedd-2), la caspase 3 (ou CPP 32).

L'implication des caspases dans l'apoptose est largement démontrée, en particulier par des expériences d'inhibition de ces enzymes. En effet, l'inhibition des caspases par des protéines virales spécifiques telles que p35 (extraite du baculovirus) ou CrmA (extraite du virus cowpox) permet de bloquer l'apoptose induite expérimentalement dans différents types cellulaires : fibroblastes privés de sérum, cellules épithéliales privées de matrice extra-cellulaire, neurones privés de NGF (Gagliardini et al, 1994 ; Nicholson et al, 1995 ; White, 1996). Des tétrapeptides synthétiques (tels que YVAD et DEVD) mimant la séquence peptidique reconnue par les caspases et se liant à leur site catalytique peuvent être utilisés pour inhiber spécifiquement les caspases : comme avec les protéines inhibitrices virales, cette inhibition entraîne le blocage de l'apoptose induite quel que soit le type cellulaire étudié (Nicholson, 1996).

L'activation des caspases peut être déclenchée de différentes manières :

- les caspases dites effectrices sont activées par des co-facteurs tels que le cytochrome c et le facteur APAF-1 ;

- d'autres caspases dites initiatrices (comme la caspase 8) peuvent être activées directement par les récepteurs de mort cellulaire de type Fas (ou CD95 ou Apo-1) par l'intermédiaire de leur domaine fonctionnel cytoplasmique (ou "death domain") en association avec le co-facteur FADD (Thorneberry et Lazebnik, 1998).

On connaît à ce jour une vingtaine de substrats des caspases en plus de la pro-interleukine-1ß, parmi lesquels les pro-caspases (précurseurs inactifs des caspases), la lamine nucléaire B, l'actine, la poly-ADP-ribose-polymérase (PARP), l'inhibiteur de la CAD (caspase-activated desoxyribonuclease). Le clivage de ces protéines par les caspases aurait pour conséquence, soit l'activation de protéines impliquées dans l'apoptose (comme les caspases elles-mêmes), soit l'inactivation de protéines impliquées dans le maintien de l'intégrité cellulaire. Plusieurs de ces conséquences ont été élucidées :

- Lorsque les lamines nucléaires sont dégradées, l'architecture nucléaire est déstabilisée et l'ADN devient accessible à la dégradation par les endonucléases (Takahashi et al, 1996).

- Le clivage de l'actine par les caspases provoque la perte de son activité inhibitrice de la DNAse I, enzyme impliquée dans la fragmentation de l'ADN au cours de l'apoptose (Kalayar et al, 1996).

- Le clivage de l'inhibiteur de la CAD par les caspases conduit à son inactivation et donc à l'activation de la CAD, enzyme directement impliquée dans la fragmentation de l'ADN au cours de l'apoptose (Zou et al, 1997 ; Thorneberry et Lazebnik, 1998).

- La dégradation de la PARP (enzyme impliquée dans la réparation de l'ADN) par les caspases pourrait entraîner un défaut de réparation de l'ADN (Cohen, 1997)

Il semble que le clivage d'un seul de ces substrats par les caspases ne soit pas suffisant pour conduire à l'apoptose : c'est probablement le clivage simultané de plusieurs protéines impliquées dans le maintien du cytosquelette cellulaire et dans la réparation de l'ADN qui est nécessaire au déroulement du processus apoptotique (Martin et Green, 1995).

d- Implication des radicaux libres de l'oxygène dans l'apoptose

Plusieurs études suggèrent que la production d'un excès de radicaux libres de l'oxygène pourrait être impliquée dans la mort cellulaire apoptotique (Buttke et al, 1994 ; Slater et al, 1995). De plus, l'apoptose de divers types cellulaires comme les hépatocytes ou les cellules HL60, peut être induite in vitro par un stress oxydatif (Mac Conkey et al, 1988 ; Lennon et al, 1991).

Par ailleurs, plusieurs travaux mettent en évidence un rôle anti-oxydant pour la protéine Bcl-2 : les cellules surexprimant le gène bcl-2 sont plus résistantes à l'apoptose induite par un stress oxydatif comme l'exposition au peroxyde d'hydrogène ou à la ménadione (Hockenbery et al, 1993). Des souris "nulles" pour bcl-2 présentent, au cours de la période post-natale, en plus d'une apoptose massive des cellules lymphoïdes, des troubles métaboliques directement en rapport avec un stress oxydatif (Veis et al, 1993). La protéine Bcl-2 pourrait exercer cette fonction antioxydante en s'opposant à la production de radicaux libres oxygénés au niveau mitochondrial ou en s'opposant à la peroxydation des lipides (Kane et al, 1993 ; Hockenbery et al, 1993). Cette fonction antioxydante du gène anti-apoptotique bcl-2 soutient l'hypothèse de l'implication des radicaux libres de l'oxygène dans l'apoptose.

Cependant, des études démontrant que l'induction de l'apoptose peut avoir lieu en l'absence d'oxygène tendent à prouver que la production de radicaux libres oxygénés n'est pas indispensable au déroulement de l'apoptose (Jacobson et Raff, 1995 ; Shimizu et al, 1995).

II - L'APOPTOSE NEURONALE

Au cours de l'organogénèse chez les Vertébrés, le nombre de neurones produits est environ le double du nombre de neurones présents dans le système nerveux central mature : la mort programmée de 50 % des neurones produits survient de façon hautement reproductible dans le temps et dans l'espace et elle est conservée à travers les espèces. Cette mort neuronale apoptotique est capitale pour le développement du système nerveux car elle permet l'adaptation du nombre de neurones connectés aux cellules cibles et la correction des erreurs de connexion (Barde, 1989 ; Oppenheim, 1991).

En dehors de cette situation physiologique, il apparaît de plus en plus évident que l'apoptose neuronale pourrait être déclenchée dans certaines situations pathologiques. Par exemple, après une ischémie cérébrale focalisée, la mort des neurones entourant le coeur de la lésion présente des caractéristiques apoptotiques telles que la fragmentation de la chromatine et l'activation des caspases (Barinaga, 1998). Par ailleurs, l'apoptose pourrait être impliquée dans la mort neuronale observée au cours de certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer. Cette question sera abordée plus en détail à la fin de ce chapitre.

L'apoptose neuronale peut être induite expérimentalement in vitro et in vivo par divers stimuli. L'utilisation de ces modèles expérimentaux a permis d'étudier l'implication dans l'apoptose neuronale de certains mécanismes moléculaires préalablement mis en évidence dans l'apoptose des cellules immunitaires.

A - PRINCIPAUX MODÈLES D'INDUCTION DE L'APOPTOSE NEURONALE IN VITRO

1 - Privation de facteurs trophiques

Les neurones, comme toutes les cellules, ont besoin pour survivre de recevoir en permanence de leur environnement des "signaux de survie" essentiellement constitués par les facteurs de croissance. En l'absence de ces signaux, les neurones déclenchent leur programme de suicide et meurent par apoptose (Barde, 1989).

Ce phénomène est probablement à l'origine de la perte neuronale massive et programmée observée au cours du développement embryonnaire : les neurones formés au cours de la phase de prolifération ne disposeraient pas tous d'un apport suffisant de facteurs de croissance par leurs cellules-cibles. L'apoptose neuronale induite par ce défaut de facteurs trophiques permettrait à chaque cellule cible d'être innervée par un nombre approprié de neurones (Barde, 1989 ; Oppenheim, 1991).

Cette théorie "neurotrophique" de la mort neuronale développementale a conduit à l'utilisation massive du modèle de privation de facteurs trophiques pour l'étude de l'apoptose neuronale in vitro :

- L'apoptose peut être induite dans des cultures primaires de neurones ou dans des lignées neuronales par la privation de facteurs neurotrophiques spécifiques : par exemple, le NGF pour les neurones sympathiques (Martin et al, 1992) ou pour les cellules PC12 (Mesner et al, 1992), le BDNF ou le CNTF pour les neurones sensitifs (Allsopp et al, 1993).

- L'utilisation d'un milieu de culture sans sérum (ou privation de sérum) est un modèle d'induction de l'apoptose in vitro très largement répandu tant pour les neurones en culture primaire que pour les lignées neuronales (Batistatou et Greene, 1993 ; Atabay et al, 1996 ; Miller et Johnson, 1996 ; Eves et al, 1996 ; Watson et al, 1998).

Les modifications métaboliques (diminution de la consommation de glucose, perturbation des fonctions mitochondriales) surviennent au cours des 12 heures suivant le début de la privation et sont rapidement suivies par les modifications morphologiques caractéristiques de l'apoptose telles que la fragmentation nucléaire. La mort cellulaire effective survient dans les 72 heures suivant le début de la privation (Deckwerth et Jonhson, 1993a, b).

2 - Toxicité du peptide ß-amyloïde

Le peptide ß-amyloïde est le principal composant des plaques séniles qui constituent une des lésions neuropathologiques caractérisant la maladie d'Alzheimer. Ce peptide, composé de 39 à 42 acides aminés, provient de la protéolyse d'une glycoprotéine transmembranaire de 695 à 770 acides aminés appelée précurseur de la protéine ß-amyloïde ou APP.

De nombreuses études in vitro démontrent que le peptide ß-amyloïde est neurotoxique (Yankner et al, 1989 ; Behl et al, 1994a ; Forloni et al, 1993 ; Loo et al, 1993 ; Pike et al, 1993). La nature de la mort neuronale induite in vitro par ce peptide est variable selon le modèle expérimental utilisé. De nombreuses études réalisées sur des cultures primaires de neurones corticaux ou hippocampiques décrivent une mort neuronale essentiellement apoptotique : elle se caractérise par la fragmentation de l'ADN neuronal (Forloni et al, 1993 ; Loo et al, 1993 ; Pike et al, 1993 ; Shearman et al, 1994; Li et al, 1996) et elle s'accompagne de l'induction du gène c-jun (Anderson et al, 1995) et de l'activation des caspases (Michaelis et al, 1998). L'analyse en microscopie électronique des modifications morphologiques neuronales induites par le peptide ß-amyloïde dans des cultures primaires de neurones hippocampiques confirme la nature apoptotique de la mort neuronale (Watt et al, 1994). Cependant, certains auteurs observent des signes de mort cellulaire nécrotique dans des cultures primaires de neurones corticaux exposés au peptide ß-amyloïde (Behl et al, 1994b). Pour certaines lignées neuronales issues de neuroblastomes humains ou dans les cellules PC12, la mort neuronale induite par le peptide ß-amyloïde est principalement nécrotique (Belh et al, 1994b ; Gschwind et al, 1995).

En résumé, l'induction par le peptide ß-amyloïde d'une mort neuronale apoptotique et/ou nécrotique semble dépendre du type neuronal étudié mais vraisemblablement aussi du protocole expérimental utilisé (notamment pour la préparation du peptide et les modalités d'exposition).

3 - Excitotoxicité

Les acides aminés excitateurs, dont le chef de file est le glutamate, sont d'importants neurotransmetteurs du système nerveux central (Fonnum, 1984). Ils sont de plus impliqués dans la différenciation neuronale au cours du développement (Mattson et al, 1988) et dans les processus d'apprentissage et de mémorisation (Mac Entee et Crook, 1993). Cependant, ces neurotransmetteurs excitateurs peuvent être neurotoxiques : une stimulation excessive de leurs récepteurs (par des concentrations supraphysiologiques et/ou une durée excessive de stimulation) provoque la mort neuronale. Ce phénomène est classiquement appelé "excitotoxicité" (Rothman et Olney, 1987 ; Choi, 1987a).

Les acides aminés excitateurs agissent sur deux principaux types de récepteurs : les récepteurs ionotropiques (récepteur NMDA et AMPA/kainate) qui sont des récepteurs-canaux et les récepteurs métabotropiques qui sont couplés à des protéines G (Pin et Duvoisin, 1995). L'excitotoxicité est un phénomène essentiellement médié par les récepteurs ionotropiques glutamatergiques (Choi, 1987b) ; les récepteurs métabotropiques interviendraient indirectement en modulant l'activité des récepteurs ionotropiques (Schoepp et Conn, 1993). Classiquement on décrit deux composantes dans la mort neuronale excitotoxique : la première, précoce, est caractérisée par un influx de sodium provoquant le gonflement et la mort rapide d'une partie des neurones ; la deuxième composante est caractérisée par un influx de calcium entraînant une cascade d'activations géniques et enzymatiques intracellulaires aboutissant à la mort plus tardive des neurones (Choi, 1987b ; Greenamyre et Young, 1989).

D'après plusieurs études plus récentes, les mécanismes de la mort neuronale excitotoxique semblent impliquer à la fois la nécrose et l'apoptose. En effet, l'implication d'un processus apoptotique dans la mort neuronale induite in vitro dans des cultures primaires par un stress excitotoxique est mise en évidence dans de nombreux travaux (Kure et al, 1991 ; Ikeda et al, 1996 ; Ankarcrona et al, 1996 ; Didier et al, 1996 ; Figiel et al, 1996). La fragmentation nucléaire est généralement observée dans les 12 à 24 heures suivant le stress excitotoxique ; elle est précédée par la fragmentation des lamines nucléaires (Ankarcrona et al, 1996) et par l'activation du gène c-jun (Cheung et al, 1998). De plus, la surexpression du gène anti-apoptotique bcl-2 dans des lignées neuronales réduit la mort cellulaire induite par le glutamate (Behl et al, 1993). L'induction de l'apoptose neuronale par l'excitotoxicité est aussi démontrée in vivo (Macaya et al, 1994 ; Kelly et Burke, 1996; Pollard et al, 1994 ; Filipkowski et al, 1994). Ceci est confirmé par une étude récente démontrant que l'inhibition des caspases atténue la mort neuronale induite chez la souris par l'injection d'acides aminés excitateurs (Hara et al, 1997).

D'autres travaux démontrent qu'un stress excitotoxique in vivo ou in vitro induit à la fois de l'apoptose et de la nécrose neuronale (Ferrer et al, 1995 ; Ankarcrona et al, 1995 ; Bonfoco et al, 1995 ; Lesort et al, 1997a). La co-existence de ces deux processus de mort neuronale peut s'expliquer par le fait que des populations

neuronales distinctes peuvent réagir de façon différente à un même stress excitotoxique, probablement parce qu'elles expriment des combinaisons différentes de récepteurs glutamatergiques. Lorsque les études sont effectuées sur des cultures primaires de neurones, on observe que la survenue de la nécrose ou de l'apoptose dépend de plusieurs facteurs. D'une part, l'intensité du stress excitotoxique peut déterminer la nature du processus de mort neuronale : l'exposition à de très fortes concentrations d'acides aminés excitateurs entraîne une mort neuronale majoritairement nécrotique alors qu'un stress moins intense provoque l'apoptose des neurones (Bonfoco et al, 1995). D'autre part, pour un même stress excitotoxique, le type de mort neuronale induite varie au cours du temps : la mort survenant au cours et immédiatement après l'intoxication est nécrotique alors que la mort neuronale observée quelques heures après le stress excitotoxique est apoptotique (Ankarcrona et al, 1995). Ces deux étapes pourraient correspondre aux deux composantes de la mort neuronale excitotoxique décrites précédemment.

Par ailleurs, certains auteurs décrivent une mort neuronale excitotoxique ne correspondant totalement ni aux caractéristiques morphologiques et biochimiques de l'apoptose, ni à celles de la nécrose : des signes d'apoptose comme la condensation cytoplasmique et la fragmentation de la chromatine peuvent être associés à des signes de nécrose tels que le gonflement du réticulum endoplasmique et des mitochondries (Regan et al, 1995 ; Isaev et al, 1996).

Récemment, une théorie unifiant ces différentes observations a été proposée: la mort neuronale excitotoxique pourrait se dérouler sous la forme d'un "continuum apoptose-nécrose". L'apoptose et la nécrose "typiques" ne représenteraient que les deux extrêmes d'une large gamme de processus se traduisant par des modifications morphologiques et biochimiques variables (Portera-Caillau et al, 1997 a et b ; Leist et Nicotera, 1998).

4 - Privation de potassium

La survie et la différenciation neuronales in vitro sont stimulées par la présence de potassium à forte concentration dans le milieu extracellulaire (Chalazonitis et Fishbach, 1980 ; Gallo et al, 1987).

L'exposition de cultures primaires neuronales à un milieu de culture dépourvu de potassium provoque la mort des neurones par apoptose (D'Mello et al, 1993) : dans des cultures de cellules en grain du cervelet, les modifications morphologiques nucléaires sont observées après 6 heures de privation ; au bout de 12 heures de privation, on observe une mort neuronale apoptotique de 50 % des cellules (Nardi et al, 1997).

5 - Stress oxydatif

L'apoptose neuronale peut être induite in vitro par un stress oxydatif, soit en exposant les neurones à des agents oxydants introduits dans le milieu extracellulaire, comme le peroxyde d'hydrogène (Whittemore et al, 1994) ou le peroxynitrite (Estevez et al, 1995), soit en provoquant une augmentation des radicaux libres oxygénés dans les neurones via l'inhibition des systèmes antioxydants intracellulaires (Troy et Shelanski, 1994 ; Ratan et al, 1994a ,b).

B - MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS L'APOPTOSE NEURONALE

1 - Implication de certains récepteurs membranaires dans l'apoptose neuronale

Le récepteur p75 (ou récepteur de basse affinité pour le NGF) pourrait être impliqué dans le déclenchement de l'apoptose neuronale en l'absence de facteurs neurotrophiques.

Lorsque ce récepteur est lié au NGF ou à d'autres facteurs neurotrophiques, il active une famille de tyrosine kinases qui aboutit à la répression de l'apoptose neuronale (Carter et Lewin, 1997). Lorsque ce récepteur n'est pas lié au NGF ou à un autre facteur neurotrophique, il semble jouer un rôle pro-apoptotique (Rabizadeh et al, 1993). Le domaine intracellulaire du récepteur p75 possèderait un "domaine de mort" analogue à celui des récepteurs de type Fas (Henderson, 1996 ; Ashkenazi et Dixit, 1998) et serait responsable du rôle pro-apoptotique de p75 : des souris transgéniques surexprimant le domaine intracellulaire de p75 présentent une importante perte neuronale dans certaines régions du système nerveux central et périphérique (Majdan et al, 1997). La structure du domaine intracellulaire du récepteur p75 ainsi que les mécanismes et les conséquences de son activation en l'absence de ligand sont encore assez mal connus. En particulier, il n'a pas été mis en évidence, au stade actuel des connaissances, d'activation directe des caspases par le domaine intracellulaire du récepteur p75 dans les neurones (Bergeron et Yuan, 1998 ; Ashkenazi et Dixit, 1998). Certains auteurs suggèrent que ce récepteur pourrait être impliqué dans l'activation des Jun-kinases (JNK) proposée comme un événement précoce de la cascade apoptotique neuronale (Bergeron et Yuan, 1998).

Il est à noter que dans certaines populations cellulaires non-neuronales comme les oligodendrocytes, le récepteur p75 peut jouer un rôle pro-apoptotique en présence de NGF (Casaccia-Bonnefil et al, 1996).

2 - Implication des gènes c-jun et c-fos dans l'apoptose neuronale

Dans les cultures de neurones privées de NGF, l'expression de c-jun et c-fos est induite juste avant l'entrée des neurones dans la phase "d'exécution" de l'apoptose (Estus et al, 1994). L'induction de ces gènes est aussi observée dans d'autres modèles d'apoptose neuronale in vitro notamment dans des neurones privés de potassium (Miller and Johnson, 1996), privés de sérum (Yardin et al, 1998a), exposés au peptide ß-amyloïde (Anderson et al, 1995) ou soumis à un stress excitotoxique (Cheung et al, 1998). In vivo, l'induction de c-fos précède la mort neuronale apoptotique induite par l'axotomie ou par un stress excitotoxique (Smeyne et al, 1993).

Le gène c-jun semble particulièrement impliqué : le blocage de son activité protège les neurones de la mort apoptotique induite par privation de facteurs trophiques (Estus et al, 1994 ; Ham et al, 1995 ; Watson et al, 1998). La phosphorylation de la protéine c-Jun, qui augmente son activité de facteur transcriptionnel, semble nécessaire à l'apoptose neuronale : en effet, lorsque l'activité des Jun-kinases (JNK) est bloquée expérimentalement, les neurones sont résistants à l'apoptose induite par la privation de facteurs trophiques (Dickens et al, 1997 ; Watson et al, 1998 ; Eilers et al, 1998). Certains auteurs suggèrent que l'induction de c-jun pourrait constituer un marqueur précoce de la mort neuronale apoptotique (Cheung et al, 1998).

Cependant l'induction des IEG n'est pas restreinte aux neurones subissant l'apoptose : elle semble être impliquée dans divers processus biologiques tels que la régénération axonale (Jenkins et al, 1993) et la mémorisation (Dragunow, 1996). Leur implication dans l'apoptose dépend probablement de l'expression d'autres protéines avec lesquelles c-Jun et/ou c-Fos interagiraient au cours de la cascade apoptotique (Herdegen et al, 1997).

3 - Implication des gènes contrôlant le cycle cellulaire dans l'apoptose neuronale

- L'expression du gène de la cycline D1 augmente au cours de l'apoptose induite par privation de NGF dans des cultures de neurones sympathiques (Freeman et al, 1994). De plus, la surexpression d'un inhibiteur des cyclines D protège les neurones de la mort apoptotique (Kranenburg et al, 1996). L'implication de la cycline D1 dans l'apoptose neuronale est décrite aussi in vivo (Guegan et al, 1997). Cependant, d'autres études sont en désaccord avec ces résultats : au cours de l'apoptose induite par privation de sérum ou de potassium dans des cultures de neurones en grain du cervelet, l'expression de la cycline D1 n'augmente pas (Miller and Johnson, 1996). Elle n'augmente pas non plus au cours de l'apoptose induite par un stess oxydatif dans des cultures de neurones sympathiques (Shirvan et al, 1998).

Ces résultats conduisent à penser que, bien que la cycline D1 soit impliquée dans l'apoptose de certains neurones, son rôle semble être variable selon les types neuronaux et les stimuli apoptotiques étudiés.

- L'expression du gène p53 est induite au cours de la mort neuronale provoquée par l'excitotoxicité (Sakhi et al, 1994). La surexpression de p53 dans des neurones sympathiques in vitro induit l'apoptose (Slack et al, 1996). In vivo, l'absence d'expression de ce gène chez des souris "nulles" protège les neurones contre l'apoptose induite par divers stimuli tels que l'adrénalectomie (Sakhi et al, 1996), les radiations ionisantes (Enokido et al, 1996), les radicaux libres (Wood et Youle, 1995). Cependant, ces souris déficientes en p53 présentent un développement cérébral normal : l'apoptose neuronale développementale n'est pas inhibée. De plus, les cultures de neurones cérébelleux issus de ces souris "nulles" pour p53 ne sont pas protégées de l'apoptose induite par des génotoxines (Wood et Youle, 1995). Le gène p53 ne semble pas impliqué non plus dans l'apoptose induite par privation de sérum dans certaines lignées neuronales (neurones hippocampiques immortalisés) (Eves et al, 1996).

L'expression du gène p53, comme celle du gène de la cycline D1 ne semble donc pas indispensable au déroulement de l'apoptose neuronale. Mais certains auteurs suggèrent que, si p53 n'induit pas par lui-même l'apoptose neuronale, il pourrait agir en rendant les neurones plus vulnérables à certains stimuli apoptotiques (Miyashita et Reed, 1995).

- Une étude récente démontre que l'apoptose induite par l'acide okadaïque sur des lignées neuronales issues de neuroblastomes humains est précédée par une initiation avortée de cycle mitotique : un début d'individualisation des chromosomes ainsi que l'expression des cyclines B1 et D1 sont observés avant l'apparition des caractéristiques morphologiques de l'apoptose (Nuydens et al, 1998). Ces observations tendent à confirmer l'hypothèse selon laquelle l'apoptose pourrait résulter chez les neurones post-mitotiques d'une tentative avortée de "ré-entrée" dans le cycle cellulaire.

4 - Implication des gènes de la famille de bcl-2 dans l'apoptose neuronale.

Le gène bcl-2 est exprimé dans le système nerveux au cours du développement embryonnaire. A partir de la naissance, son expression diminue et à l'âge adulte, on ne détecte plus que de très faibles taux de protéine Bcl-2 dans le système nerveux central (Abe-Dohmae et al, 1993 ; Merry et al, 1994).

Le rôle protecteur de bcl-2 dans la mort neuronale est démontré par de nombreuses études. In vitro, la surexpression de bcl-2 dans des lignées neuronales (Mah et al, 1993 ; Batistatou et al, 1993) ou dans des cultures primaires de divers types neuronaux (Garcia et al, 1992 ; Allsopp et al, 1993) prévient l'apoptose induite par privation de facteurs trophiques. Les neurones surexprimant bcl-2 se montrent aussi plus résistants à la mort induite par d'autres stimuli tels que l'excitotoxicité (Zhong et al, 1993a), la privation de glucose (Zhong et al, 1993b), le stress oxydatif (Kane et al, 1993), ou le traitement par l'ionophore de calcium (Mah et al, 1993). In vivo, la surexpression de bcl-2 inhibe la mort des motoneurones induite par axotomie (Dubois-Dauphin et al, 1994 ; Farlie et al, 1995).

Au cours de l'apoptose neuronale développementale, le rôle de bcl-2 est moins clair : des souris transgéniques surexprimant bcl-2 présentent un excès de neurones tant au niveau du cerveau que de la moelle épinière (Martinou et al, 1994; Farlie et al, 1995). Par contre, des souris déficientes en bcl-2 se développent normalement et ne présentent pas de diminution du nombre de neurones à la naissance ; cependant, chez ces animaux, plusieurs populations neuronales subissent une dégénérescence importante au cours de la période post-natale (Michaelidis et al, 1996).

Ces observations suggèrent que le rôle protecteur de bcl-2 est capital pour la survie neuronale post-développementale mais n'est pas indispensable au cours de la période embryonnaire. Ceci est probablement corrélé à la redondance des membres de la famille Bcl-2 au cours du développement du système nerveux. En effet, d'autres gènes anti-apoptotiques de cette famille tels que bcl-x et mcl-1 sont exprimés dans le système nerveux central au cours du développement (Frankowski et al, 1995 ; Gonzalez-Garcia et al, 1995) : il est probable que ces gènes jouent un rôle plus important que bcl-2 dans la régulation de l'apoptose neuronale développementale.

Cette idée est confirmée par l'étude de souris déficientes en bcl-x : ces animaux subissent une mort neuronale apoptotique massive au cours du développement embryonnaire et meurent in utero (Motoyama et al, 1995). Le gène bcl-x est aussi impliqué, comme bcl-2, dans la survie des neurones post-mitotiques : des cultures de neurones déficients en bcl-x sont beaucoup plus vulnérables à l'apoptose induite par la privation de facteurs trophiques (Roth et al, 1996).

Le gène bax, un autre membre de la famille de bcl-2, est exprimé dans le système nerveux central au cours du développement (Vekrellis et al, 1997). Contrairement à bcl-2 et bcl-x, le gène bax joue un rôle pro-apoptotique : la microinjection de bax dans des cultures de neurones sympathiques entraîne l'apoptose neuronale même en présence de NGF (Vekrellis et al, 1997). Des souris déficientes en bax présentent à la naissance un nombre augmenté de neurones sympathiques et de motoneurones ; ces neurones survivent à l'apoptose induite respectivement par la privation de NGF in vitro et par l'axotomie (Deckwerth et al, 1996). Ces résultats confirment l'implication de bax dans l'apoptose développementale et pathologique pour certaines populations neuronales.

5 - Implication des caspases dans l'apoptose neuronale

Comme dans les autres types cellulaires, l'activation des caspases est impliquée dans l'apoptose neuronale : l'inhibition de ces enzymes protège les neurones de l'apoptose induite par différents stimuli (Gagliardini et al, 1994 ; Rabizadeh et al, 1995 ; Schwartz et Milligan, 1996).

A notre connaissance, l'activation précoce des caspases dites initiatrices (survenant en amont de la cascade apoptotique dans les lymphocytes) n'a pas encore été mise en évidence dans les neurones. Deux études récentes ont permis de préciser la position des caspases dans la cascade de l'apoptose neuronale :

- Les caspases interviennent en aval de l'induction de c-fos et c-jun car le blocage de l'apoptose par un inhibiteur synthétique des caspases dans des neurones sympathiques n'empêche pas l'induction de c-jun et c-fos causée par la privation de NGF (Deshmukh et al, 1996).

- Les caspases interviennent aussi en aval de l'induction des gènes de la famille de bcl-2 car l'activation des caspases observée au cours de l'apoptose est bloquée chez des lignées neuronales surexprimant bcl-2 (Srinivasan et al, 1996).

Des expériences d'inactivation génique ont permis de préciser l'implication des différents types de caspases dans l'apoptose neuronale :

- la caspase 3 (CPP 32) joue un rôle prépondérant dans l'apoptose neuronale développementale : des souris déficientes en CPP32 présentent un défaut d'apoptose neuronale au cours du développement embryonnaire et meurent au cours des 3 semaines qui suivent leur naissance avec un cerveau hypertrophié (Kuida et al, 1996) ;

- la caspase 1 (ICE) semble plutôt impliquée dans l'apoptose des neurones post-mitotiques : des souris "nulles" pour le gène de la caspase 1 possèdent des neurones plus résistants à la mort neuronale induite par l'ischémie et présentent moins de déficits neurologiques que les souris contrôles soumises à la même ischémie. Les cultures de neurones réalisées à partir des cerveaux de ces souris "nulles" sont plus résistantes à l'apoptose induite par la privation de sérum (Friedlander et al, 1997).

L'utilisation de peptides inhibiteurs sélectifs des caspases a permis de démontrer que pour un même type neuronal, l'apoptose induite par différents stimuli peut mettre en jeu des caspases différentes : le blocage des caspases de type ICE dans des neurones sympathiques en culture inhibe l'apoptose induite par une sous-expression de la superoxyde dismutase 1 (SOD1) mais pas l'apoptose induite par privation de facteurs trophiques (Troy et al, 1996). A l'inverse, pour le même type de neurones, le blocage de la caspase 2 (Nedd-2) inhibe l'apoptose induite par la privation de facteurs trophiques mais pas celle induite par l'inhibition de la SOD1 (Troy et al, 1997). Dans des cultures de neurones sensitifs, l'apoptose induite par privation de sérum est bloquée par les inhibiteurs spécifiques de la caspase 3 mais pas par ceux de la caspase 1 (Mukasa et al, 1997).

L'ensemble de ces résultats suggère que les membres des trois familles de caspases interviennent dans l'apoptose neuronale avec un degré de responsabilité différent selon le type neuronal, le degré de maturité des neurones et le type de stimulus apoptotique.

6 - Implication des radicaux libres de l'oxygène dans l'apoptose neuronale

L'apoptose neuronale induite par divers stimuli tels que la privation de facteurs trophiques (Greenlund et al, 1995 ; Satoh et al, 1996), la privation de potassium (Schulz et al, 1996), l'exposition au peptide ß-amyloide (Behl et al, 1994a), l'excitotoxicité (Bonfoco et al, 1995), l'ischémie (Linnik et al, 1995) s'accompagne d'une augmentation de production de radicaux libres de l'oxygène.

L'action de molécules antioxydantes ou d'enzymes de détoxification des radicaux libres peut inhiber l'apoptose neuronale induite expérimentalement (Bonfoco et al, 1995 ; Ratan et al, 1994 ; Satoh et al, 1996), mais cette protection n'est pas observée dans tous les cas. Par exemple, la microinjection de superoxyde-dismutase 1 dans des neurones symphathiques n'inhibe pas l'apoptose induite par la privation de NGF ; de plus, la ré-addition de NGF dans ces cultures prévient la mort apoptotique des neurones alors que l'augmentation des taux intracellulaires de radicaux libres s'est déjà produite (Greenlund et al, 1995).

Ces observations suggèrent que si les radicaux libres de l'oxygène ne déclenchent pas par eux-mêmes l'apoptose neuronale, ils pourraient cependant intervenir en abaissant la résistance des neurones à l'apoptose.

Pour tenter de résumer l'ensemble des mécanismes moléculaires impliqués dans l'apoptose neuronale, nous proposons une représentation schématique hypothétique de la cascade apoptotique survenant lors de la privation de facteurs trophiques (Figure 7).

C - APOPTOSE NEURONALE ET MALADIES NEURODÉGÉNÉRATIVES

1 - Apoptose neuronale et maladie d'Alzheimer

La maladie d'Alzheimer est associée à une importante perte neuronale (Morrison et Hof, 1997). La perte cellulaire observée dans le cortex entorhinal apparaît comme un événement très précoce de la maladie alors que la perte neuronale massive observée dans le sulcus temporal supérieur semble survenir plus tardivement et s'accroître avec la durée et la sévérité de la maladie. Cette perte neuronale n'est pas retrouvée chez les sujets âgés non déments (Gomez-Isla et al, 1997a, b). De nombreux travaux suggèrent que l'apoptose pourrait être impliquée dans la mort neuronale survenant au cours de la maladie d'Alzheimer.

- Le premier argument soutenant cette hypothèse est l'observation dans les cerveaux Alzheimeriens d'un grand nombre de neurones présentant une fragmentation de l'ADN ( Su et al, 1994 ; Lassman et al, 1995 ; Smale et al, 1995 ; Cotman et Anderson, 1995 ; Anderson et al, 1996 ; Kusiak et al, 1996 ; Sugaya et al, 1997). Toutes ces études utilisent la technique du TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling) : cette méthode, basée sur le marquage des extrémités 3' libres de l'ADN, est classiquement utilisée pour la mise en évidence de la fragmentation de l'ADN caractéristique de l'apoptose.

Dans les cerveaux Alzheimeriens, le marquage de la fragmentation de l'ADN prédomine dans le cortex entorhinal mais est aussi présent dans l'ensemble de la formation hippocampique, dans le cortex pariétal et temporal alors qu'il est absent dans les cerveaux de sujets âgés non déments (Lassman et al, 1995 ; Lucassen et al, 1997). Il est aussi observé dans le cortex occipital en l'absence de dégénérescence neurofibrillaire, cette lésion apparaissant généralement tardivement dans cette région. De plus, la fragmentation de l'ADN est observée dans des cas peu sévères de maladie d'Alzheimer où peu de DNF sont présentes. Ces observations suggèrent que la fragmentation de l'ADN pourrait se produire antérieurement et/ou indépendamment de la formation des DNF (Su et al, 1997 ; Cotman, 1998). Cette hypothèse est soutenue par le fait que la fragmentation de l'ADN est souvent observée dans des neurones ne présentant pas de dégénérescence neurofibrillaire, bien qu'elle puisse aussi être détectée dans des neurones contenant des protéines tau pathologiques  (Su et al, 1994 ; 1997) ainsi que dans les cellules gliales (Smale et al, 1995). Par ailleurs, la fragmentation de l'ADN est fréquemment associée à une accumulation intraneuronale de protéine ß-amyloïde et est souvent observée à proximité des plaques séniles (La Ferla et al, 1997 ; Sheng et al, 1998).

Il n'existe pas, à notre connaissance, d'étude ayant déterminé si cette fragmentation atteint des populations neuronales particulières. L'existence d'une progression hiérarchisée ou chronologique de la fragmentation de l'ADN au sein des différentes régions cérébrales au cours de la maladie d'Alzheimer n'a pas été mise en évidence.

La signification de cette fragmentation de l'ADN dans les cerveaux Alzheimeriens pose problème : est-ce rééllement une preuve d'apoptose neuronale?

Classiquement, on estime que la fragmentation de la chromatine survient au stade quasi-terminal de l'apoptose, juste avant la fragmentation de la cellule en corps apoptotiques et sa disparition. Or, dans certaines régions du cerveau, il a été observé jusqu'à 70 % de neurones affectés par une fragmentation de l'ADN : la perte rapide d'une telle proportion de neurones ne paraît pas compatible avec la durée d'évolution de la maladie.

De plus, la fragmentation de l'ADN observée dans les cerveaux Alzheimeriens n'est pas associée à un profil de migration électrophorétique en échelle typique de l'apoptose (Anderson et al, 1996). Il semble donc improbable que la fragmentation de l'ADN neuronal observée dans les cerveaux Alzheimeriens soit le témoignage d'un processus apoptotique "classique" (Perry et al, 1998). Elle pourrait cependant refléter un état pathologique des neurones dans les cerveaux Alzheimeriens : ces lésions de l'ADN pourraient par exemple être le signe d'une vulnérabilité accrue des neurones à des perturbations métaboliques (Cotman, 1998; Stadelmann et al, 1998).

Il existe cependant d'autres arguments en faveur de l'apoptose neuronale dans la maladie d'Alzheimer :

- Des gènes dont l'induction est impliquée dans la mort cellulaire apoptotique sont exprimés dans les cerveaux Alzheimeriens :

• Le gène "pro-apoptotique" bax est largement exprimé dans les cerveaux Alzheimeriens par rapport aux cerveaux témoins. La plupart des neurones présentant une fragmentation de l'ADN expriment la protéine Bax (Su et al, 1997).

Un fort marquage immunohistochimique de la protéine Bax est aussi observé au niveau des plaques séniles, particulièrement au niveau des éléments neuritiques de ces plaques (Mac Gibbon et al, 1997). Par contre, les neurones présentant des protéines tau-PHF n'expriment généralement pas le gène bax (Nagy et Esiri, 1997 ; Su et al, 1997). Ces observations suggèrent que l'induction du gène bax ne serait pas impliquée dans la formation des dégénérescences neurofibrillaires mais pourrait l'être dans la formation des plaques séniles.

• Les résultats concernant l'expression du gène bcl-2 dans les cerveaux Alzheimeriens sont très controversés : certains auteurs observent un marquage immunohistochimique augmenté de la protéine Bcl-2 notamment dans les neurones présentant une fragmentation de l'ADN et dans les neurones présentant des protéines tau pathologiques  au stade "pré-PHF" (Su et al, 1996). A l'inverse, une étude plus récente ne retrouve pas de marquage neuronal de la protéine Bcl-2 (ni de la protéine Bcl-x) dans les cerveaux Alzheimeriens (Nagy et Esiri, 1997). L'étude des ARN messagers de bcl-2 ne montre pas de modification de leur expression dans les cerveaux Alzheimeriens par rapport aux cerveaux témoins (Vyas et al, 1997).

• Les gènes c-fos et c-jun, dont l'induction est observée au cours de l'apoptose neuronale expérimentale, sont plus fortement exprimés dans les cerveaux Alzheimeriens que dans les cerveaux de sujets âgés non déments : le marquage immunohistochimique des protéines c-Fos et c-Jun est augmenté dans le cortex entorhinal et dans l'ensemble de la formation hippocampique mais pas dans le cervelet. Ce marquage est associé de façon quasi-constante avec la fragmentation de l'ADN, mais il n'est généralement pas associé avec le marquage des protéines tau-PHF (Zhang et al, 1992 ; Anderson et al, 1996).

• Une augmentation de l'expression du gène p53 et du récepteur Fas a aussi été démontrée dans les cerveaux Alzheimeriens par rapport aux cerveaux de sujets âgés non déments. Le marquage de la protéine p53 est observé dans les neurones présentant une fragmentation de l'ADN et dans les neurones qui ne contiennent pas de tau-PHF (De la Monte et al, 1997).

- Un autre argument en faveur de l'implication de l'apoptose neuronale dans la maladie d'Alzheimer est apporté par une étude très récente : Yang et collaborateurs (1998) ont mis au point une méthode de détection de l'apoptose neuronale basée sur la mise en évidence du clivage de l'actine (l'actine étant un des substrats des caspases qui sont activées au cours de la phase d'exécution de l'apoptose). L'utilisation d'un anticorps dirigé contre les fragments d'actine permet un marquage hautement spécifique des neurones apoptotiques à la fois sur des cultures de neurones et sur des coupes de cerveaux. Les études immunohistochimiques réalisées avec cet anticorps sur des coupes de cerveaux Alzheimeriens révèlent le marquage de nombreux neurones particulièrement dans les zones riches en plaques séniles, alors qu'aucune immunoréactivité n'est observée dans les cerveaux témoins.

- Enfin, l'étude des gènes impliqués dans certaines formes familiales de maladies d'Alzheimer conduit à penser que l'apoptose neuronale pourrait être impliquée dans la pathogenèse de la maladie. Au stade actuel des connaissances, trois gènes ont été identifiés codant respectivement pour l'APP, la préséniline 1 (PS1) et la préséniline 2 (PS2).

• Les conséquences des mutations du gène de l'APP ont été étudiées in vitro et in vivo : la plupart de ces mutations conduisent à une augmentation de production du peptide ß-amyloïde (Scheuner et al, 1996 ; Hardy, 1997). Or, comme nous l'avons vu précédemment, le peptide ß-amyloïde peut provoquer l'apoptose neuronale in vitro dans certains modèles expérimentaux.

• Les conséquences des mutations des gènes des présénilines ont aussi été étudiées in vitro et in vivo : d'une part, ces mutations semblent interférer avec le métabolisme de l'APP et conduisent à une production augmentée de peptide ß-amyloïde (Scheuner et al, 1996). D'autre part, l'expression des gènes PS1 et PS2 mutés rend les neurones plus vulnérables à l'apoptose (Wolozin et al, 1996 ; Guo et al, 1996 ; 1997). La surexpression des gènes non mutés de ces protéines provoque aussi une augmentation de l'apoptose neuronale (Deng et al, 1996 ; Czech et al, 1998).

Malgré l'ensemble de ces observations, l'implication de l'apoptose neuronale dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer reste controversée au stade actuel des connaissances. En particulier, la durée de l'évolution de cette maladie semble difficilement compatible avec l'existence d'un processus apoptotique, classiquement caractérisé par sa rapidité.

Cependant, le fait que les neurones soient des cellules non renouvelables, dont la perte -donc irréversible- peut avoir des conséquences dramatiques pour l'organisme permet d'émettre l'hypothèse que ces cellules pourraient avoir développé un système particulier de contrôle de l'apoptose. Ainsi, l'apoptose des neurones adultes pourrait différer de celle des cellules prolifératives : alors que cette dernière se produit très rapidement dans l'organisme, l'apoptose des neurones matures pourrait se dérouler sur une période beaucoup plus longue (plusieurs mois ou années ?) grâce à l'existence de systèmes de régulation particuliers visant à protéger l'organisme (dans certaines limites) d'une perte neuronale massive.

2 - Autres maladies neurodégénératives

Un certain nombre d'arguments permettent de suggérer l'implication d'un processus apoptotique dans la perte neuronale observée dans d'autres maladies neurodégénératives :

• La sclérose latérale amyotrophique (SLA) se caractérise par la perte progressive des motoneurones entraînant l'atrophie des muscles squelettiques et leur paralysie. L'étude post-mortem de la moelle épinière de patients atteints de SLA permet d'observer une fragmentation de l'ADN motoneuronal qui n'est pas retrouvée chez les sujets témoins (Yoshiyama et al, 1994 ; Troost et al, 1995). Chez les souris transgéniques exprimant le gène responsable des formes familiales de SLA (gène de la SOD cuivre/zinc), la surexpression du gène anti-apoptotique bcl-2 atténue la perte des motoneurones (Kostic et al, 1997).

• La maladie de Parkinson se caractérise par la perte progressive des neurones dopaminergiques du système nigro-striatal entraînant les signes cliniques de la maladie : akinésie, rigidité, tremblement. L'étude en microscopie électronique des cerveaux de patients Parkinsoniens révèle que ces neurones dopaminergiques meurent par apoptose (Ruberg et al, 1997). De plus, l'expression du gène p53, impliqué dans l'apoptose, est augmentée dans les cerveaux Parkinsoniens par rapport aux cerveaux témoins (de la Monte et al, 1998).

• L'expression du gène p53 ainsi que celle du gène codant pour le récepteur CD95 sont augmentées dans les cerveaux de patients atteints d'autres maladies neurodégénératives comme la démence à corps de Lewy diffus ou la maladie de Pick, suggérant l'existence d'un processus apoptotique dans ces affections (de la Monte et al, 1997).