Françoise Esclaire: Expression des mRNA de tau et actine

Stéphanie Ferreira: apoE, récepteurs, RT-PCR

Autres méthodes

VI - EVALUATION DU NIVEAU D'EXPRESSION DES ARN MESSAGERS DE TAU ET DE L'ACTINE-b

A - Sondes d'hybridation

Le marquage des ARNm a été réalisé à l'aide de sondes oligonucléotidiques de synthèse (Eurogentec) :

- Sonde tau : sonde de 40 bases, complémentaire de la séquence 266-305 de l'ADNc de la protéine tau de rat (Kosik et al, 1989). Cette sonde reconnaît spécifiquement une séquence commune à tous les ARNm de la protéine tau de rat. Sur Northern blot, elle reconnait une bande à 6 kb correspondant à ces ARNm (Figure 5).

- Sonde actine-b : sonde de 40 bases complémentaire de la séquence 475-514 de l'ADNc de l'actine-b de rat. Cette sonde reconnaît spécifiquement une séquence commune à tous les ARNm de la b-actine de rat (Nudel et al, 1983). Sur Northern blot, elle reconnaît une bande à 1,8 kb correspondant à ces ARNm (Figure 5).

Avant d'utiliser ces sondes pour nos expérimentations, nous avons effectué des contrôles de spécificité :

- Pour chaque sonde, des hybridations in situ ont été réalisées en introduisant dans le tampon d'hybridation une quantité croissante de sonde non marquée : la sonde marquée et la sonde non marquée étant en compétition vis-à-vis des ARNm à hybrider, on doit observer une diminution du marquage microautoradiographique inversement proportionnelle à la quantité de sonde radioactive présente.

- L'adjonction d'une sonde oligonucléotidique différente (à la même concentration) dans le tampon d'hybridation contenant la sonde marquée étudiée ne doit pas diminuer le marquage autoradiographique : si la sonde étudiée est spécifique, son hybridation avec les ARNm recherchés ne doit pas être modifiée par la présence d'un autre oligonucléotide.

Les résultats des contrôles de spécificité réalisés pour la sonde tau sont présentés dans la figure 6.

B - Hybridation in situ quantitative

1 - Marquage des sondes par "tailing" avec un radioisotope : le soufre 35

(d'après Normand et Bloch, 1992).

Le marquage des sondes est réalisé par l'accrochage de dATP-S35 (Amersham) à leur extrêmité 3' ("tailing") par la déoxynucléotidyl terminal transférase (tdt) (Amersham).

Le marquage est effectué extemporanément avant chaque hybridation, la sonde étant préalablement chauffée à 65°C (5 minutes) afin d'éviter les auto-appariements. Pour une hybridation en bain, le marquage de 50 ng de sonde est réalisé avec 3ml de dATP-S35 (1500Ci/m mole) et 1ml de tdt (200 unités/ml). L'accrochage des nucléotides radiomarqués à la sonde est obtenu par une incubation de 90 minutes à 37°C. La réaction est stoppée par l'adjonction de 2ml d'EDTA (0,2M ; pH7,2).

On procède ensuite à la séparation de la sonde marquée du reste du milieu d'incubation par chromatographie sur gel Séphadex (G50 Medium, Pharmacia). Après passage de la sonde sur la colonne de gel, on collecte des fractions de 10 gouttes dans 20 tubes différents. La radioactivité de chaque fraction est mesurée sur compteur à scintillation (Packard) (après prélèvement de 2ml de chaque fraction). On obtient un premier pic de radioactivité, généralement dans 2 ou 3 des premières fractions recueillies, correspondant à la sonde marquée. On trouve aussi un deuxième pic de radioactivité très étalé (dans les fractions suivantes) correspondant à la radioactivité libre (nucléotides radiomarqués non accrochés à la sonde). Les fractions contenant le 1er pic de radioactivité sont réunies. La sonde présente dans ces fractions est précipitée par l'addition de NaCl 4M (1vol/10vol) et d'éthanol absolu (3vol/1vol). Les tubes contenant la sonde sont ensuite placés pendant au moins une nuit à - 20°C. La récupération de la sonde est effectuée par centrifugation (12 000 RPM, pendant 1 heure à 4°C) puis aspiration du surnageant à l'aide d'une seringue (la radioactivité du surnageant - normalement faible - peut être mesurée au compteur à scintillation afin de s'assurer que la sonde a bien précipité). Le séchage du culot est effectué par évaporation sous vide pendant quelques minutes. Le culot sec ainsi obtenu peut être utilisé directement pour l'hybridation.

2 - Protocole d'hybridation

a - Préparation des lames

Les cellules destinées à être étudiées par hybridation in situ sont mises en culture sur des lamelles de verre (cf I.B). Après induction expérimentale de la mort neuronale, les cultures sont fixées par le PAF (1% dans PBS) pendant 30 minutes puis rincées trois fois avec du PBS. Les cultures sont ensuite déshydratées par des bains rapides d'éthanol (70°, 95° puis 100°) puis séchées à température ambiante. Les lamelles sont ensuite montées sur lames de verre (la face portant les cellules vers le haut) avec une résine synthétique (Eukitt) afin de permettre des manipulations plus aisées au cours de l'hybridation.

Les cultures ainsi préparées peuvent être stockées plusieurs semaines à

-20°C avant de procéder à l'hybridation.

b - Préhybridation

Avant de procéder à l'hybridation, les lames doivent être traitées par un tampon de préhybridation (tableau 3) : 2 bains sont effectués (15 minutes puis 45 minutes). Après deux rinçages de 10 minutes dans du tampon SSC (4X), les lames sont plongées dans un bain d'acétylation (tableau 4) pendant 10 minutes dans le but de diminuer le bruit de fond du marquage (Normand et Bloch, 1992). Après ce traitement, les lames sont déshydratées par 4 bains rapides dans l'éthanol absolu puis séchées à température ambiante.

c - Hybridation en bain

Afin d'obtenir un marquage autoradiographique le plus homogène possible (dans le but de quantifier et de comparer le marquage obtenu sur toutes les lames), les lames ne sont pas hybridées individuellement mais collectivement dans un bain de tampon d'hybridation (Bernard et al, 1992).

La composition du tampon d'hybridation est indiquée dans le tableau 5. Pour chaque bain, 18ml de tampon d'hybridation sont préparés extemporanément auxquels sont ajoutés 50ng de sonde marquée (environ 3pg/ml de tampon d'hybridation). Les lames sont plongées verticalement dans un Hellendall contenant le tampon d'hybridation et la sonde marquée : l'hybridation s'effectue à 40°C (au bain-marie) sous légère agitation pendant une nuit.

d - Post-hybridation

Au terme de la période d'hybridation, les lames sont retirées du tampon d'hybridation et sont soumises à une série de lavages dans le but d'éliminer au maximum les marquages aspécifiques. Ces lavages successifs sont effectués à une température croissante et dans des solutions salines de concentration décroissante :

- un premier lavage rapide est effectué dans un bain de SSC 4X froid (4°C),

- puis les lames subissent deux lavages (15 minutes puis 45 minutes) dans du SSC 1X à température ambiante,

- deux derniers lavages sont réalisés à 40°C dans du SSC 0,1X (15 minutes puis 45 minutes).

Au terme de cette post-hybridation, les lames sont déshydratées par 4 bains rapides dans l'éthanol absolu puis séchées à l'air libre.

e - Détection du marquage microautoradiographique

Afin de détecter la présence de la sonde radioactive au niveau cellulaire les lames sont recouvertes d'une fine couche d'émulsion photographique (Emulsion K5, Ilford). L'émulsion est diluée dans du SSC 1X (1 vol/2 vol) et chauffée à 40°C : les lames sont immergées brièvement dans l'émulsion (d'un mouvement lent et régulier afin d'obtenir une couche uniforme d'émulsion sur les lames) et mises à sécher verticalement à température ambiante. Toutes ces manipulations doivent être effectuées à l'obscurité (ou en présence d'une faible lumière monochromatique rouge). Les lames émulsionnées sont stockées à 4°C à l'abri de la lumière et de l'humidité pendant une période de 6 à 9 semaines.

Après 6 semaines d'exposition on procède à des essais de révélation du marquage. Lorsque le marquage atteint une intensité satisfaisante on procède à la révélation de l'ensemble des lames : les lames sont plongées dans un bain de révélateur photographique (D19, Kodak) pendant 5 minutes, rincées 3 fois à l'eau distillée puis plongées pendant 20 minutes dans un bain de fixateur photographique. Après un rinçage de 30 minutes à l'eau distillée on peut procéder à la contre-coloration (bleu de toluidine 0,25%) ou à d'autres marqages selon les expérimentations.

f - Quantification du marquage microautoradiographique

La présence de la sonde radioactive hybridée sur les ARNm recherchés se traduit, après révélation de l'émulsion photographique, par la présence de grains d'argent sur les cellules. La quantification de ce marquage microautoradiographique est réalisée par le comptage des grains d'argent sur les cellules selon la méthode de Bisconte, grâce à une station d'analyse d'image informatisée Biocom (logiciel Historag). Le repérage des contours cellulaires et les mesures des surfaces cellulaires sont réalisés au microscope en éclairage classique. Le comptage des grains est réalisé en éclairage épifluorescent : la lumière est alors réfléchie par les grains d'argent. La quantité de lumière réfléchie par cellule est mesurée et convertie en nombre de grains grâce à une courbe étalon. Les résultats sont exprimés en densité de grains, c'est-à-dire en nombre de grains par unité de surface cellulaire.

C - Hybridation après transfert des ARN sur membrane

1 - Extraction des ARN totaux

L'extraction des ARN totaux à partir des cultures a été réalisée à l'aide d'un kit (RNA+, Bioprobe) basé sur la méthode phénol/chloroforme. Pour chaque condition expérimentale, l'extraction a été réalisée à partir de 4 à 6 boites de cultures de 35 mm (soit environ 6 à 8 x 106 cellules). Après précipitation par l'isopropanol puis par l'éthanol 75°, les ARN sont dissous dans 100mm d'eau distillée autoclavée. La concentration des ARN est déterminée par la mesure de la densité optique à 260 nm sur spectrophotomètre UV (Hitachi) et leur pureté contrôlée par une mesure à 280 nm. Les ARN totaux sont stockés à -80°C jusqu'à la réalisation du transfert sur membrane.

2 - Transfert sur membrane par la technique du "Northern blotting"

La séparation électrophorétique des ARN totaux est effectuée sur gel d'agarose 1,2% contenant 2,2M de formaldéhyde. Pour chaque condition expérimentale, 15 ou 20 mg d'ARN totaux (selon les expérimentations) ont été déposés dans le gel. Pour les mêmes échantillons, un gel de contrôle (agarose 1%) coloré par le bromure d'éthidium (0,1 µg/ml) est réalisé en parallèle (avec 1mg d'ARN) afin de vérifier l'intégrité des ARN et l'homogénéité des quantités d'ARN présentes dans chaque échantillon.

Après une migration de 2H30 à 3H (à 110V), le transfert des ARN sur membrane de nylon (Hybond, Amersham) est réalisé selon la méthode du transfert par capillarité. Après une nuit de transfert, la membrane est rincée (SSC 2X), séchée à l'air libre et placée 3 minutes sous éclairage UV (254nm) afin d'assurer l'accrochage des ARN.

Les membranes ainsi préparées peuvent être utilisées directement pour l'hybridation ou stockées à 4°C pendant plusieures semaines.

3 - Transfert sur membrane par la technique du "dot blotting"

Pour certaines expérimentations, le transfert des ARN a été réalisé par dot blotting à l'aide de l'appareil Mannifold I (Schleicher & Schuell). 15 µg d'ARN totaux sont déposés dans chaque puits et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell). Pour chaque série expérimentale, les échantillons d'ARN sont déposés en double afin de pouvoir être hybridés avec 2 sondes différentes. Après le transfert, les membranes sont placées à -80°C pendant 2 heures pour assurer l'accrochage des ARN.

Parallèlement à ces manipulations, un gel de contrôle coloré au bromure d'éthidium, est réalisé avec 1mg de chaque échantillon afin de vérifier l'intégrité des ARN.

4 - Hybridation sur membrane

Les membranes obtenues par Northern blot ou dot blot sont hybridées avec les sondes oligonucléotidiques décrites précédemment. Le marquage de la sonde est effectué selon le même protocole que pour l'hybridation in situ mais avec un radioisotope différent, le phosphore 32 (P32). Pour chaque hybridation, 100 ng de sonde sont marqués extemporanément au P32.

Les membranes (nitrocellulose ou nylon) sont préalablement préhybridées : après un préchauffage à 42°C dans du SSC 2X, les membranes sont plongées dans un bain de préhybridation (tableau 6) à 42°C pendant 3 à 4 heures dans un four rotatif à hybridation (Hybaid, Schleicher & Schuell). Le tampon de préhybridation est ensuite remplacé par le tampon d'hybridation (tableau 6) contenant la quantité appropriée de sonde marquée au P32 : on utilise généralement 100 ng de sonde marquée pour 10 ml de tampon d'hybridation. Les membranes sont laissées en contact avec le tampon d'hybridation contenant la sonde pendant une nuit à 42°C sous agitation (four rotatif).

Après hybridation, les membranes sont soumises à des lavages successifs à température croissante par une solution de SSC 0,5X/SDS 0,1% : le premier lavage (10 minutes) est effectué à température ambiante puis 3 lavages de 20 minutes sont effectués à 65°C sous agitation (four rotatif). Les membranes sont ensuite exposées sur film rayons X (X-omat, Kodak ou Hyperfilm, Amersham) à -80°C pendant 1 à 3 jours selon les expérimentations.

Après révélation du film, le marquage autoradiographique est quantifié par analyse densitométrique à l'aide d'un logiciel de quantification.

5 - Déshybridation des membranes

Les membranes de Northern blot hybridées avec la sonde tau ont été déshybridées selon le protocole suivant : après exposition sur film et quantification du marquage, les membranes sont lavées pendant au moins 2 heures à 65°C par du SSC, 0,5X/SDS 0,1%. Après la déshybridation, l'absence de tout marquage résiduel est vérifiée par une exposition sur film de 24 heures. Les membranes peuvent être ensuite réhybridées avec une sonde différente (actine-ß) selon le protocole décrit précédemment.

5. AMPLIFICATION D' ARNmessagers PAR RT-PCR (Stéphanie Ferreira)

5.1 Extraction de l'ARN total 

A l'aide du kit d'extraction Talent (Euromedex), l'ARN total des cellules de tératocarcinome (NT2) a été purifié à différents stades de différenciation. La méthode d'extraction repose sur la capacité de l'ARN à se lier de façon spécifique à une matrice de silice en forte concentration de sels. Les contaminants ADN et protéiques sont ensuite éliminés pas deux lavages successifs et l'ARN est finalement élué dans 70µl d'eau.

L'ARN est dosé par spectrophotométrie à 260nm et sa pureté est vérifiée en calculant le rapport DO₂₆₀/DO₂₈₀ qui doit se situer entre 1.7 et 2.0. Son intégrité est vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% (p/v). Les échantillons d'ARNs sont précipités dans deux volumes et demi d'éthanol absolu et 1/10 volume d'acétate de sodium 3M et placés à ?0°C une nuit avant d'être repris et amenés à une concentration de 200 µg/ml.

5.2 Technique de RT-PCR

Pour les récepteurs LDL, Scavenger et VLDL, nous avons repris les séquences des oligonucléotides publiées (Pietsch et al., 1996 ; Sakai et al., 1994). Pour les autres récepteurs, les oligonucléotides ont été choisis après consultation d'une banque de données (GENBANK) et d'un logiciel de recherche de couples d'oligonucléotides (Primers for the World). Les couples d'oligonucléotides sont récapitulés dans le tableau 2.

L'amplification des ARNs messagers a été réalisée à l'aide d'un kit de RT-PCR (Promega) permettant d'effectuer les étapes de transcription inverse et d'amplification de l'ADNc dans un même tube. 1mg d'ARN total est ajouté au milieu réactionnel contenant 0.2mM d'un mix de : 1mM MgSO₄, 20 picomoles des oligonucléotides sens et antisens et 0.1u/µg de chaque enzyme (AMV et Tfl polymérase). L'ARN total est transcrit en ADNc durant une étape de 45 minutes à 48°C suivie d'une dénaturation à 94°C pendant 10 minutes. L'amplification de l'ADNc est faite pendant 30 cycles composés de deux minutes de dénaturation à 94°C, 30 secondes d'hybridation des amorces à 58°C et 1 minute d'élongation durant les 15 premiers cycles puis 2 minutes lors des derniers cycles à 68°C. Les contrôles négatifs ne contiennent pas d'ARN, substitué par de l'eau. L'identité des bandes amplifiées a été confirmée par la taille de l'ampligène obtenu ainsi que par digestion par restriction enzymatique.

5.3 Electrophorèse sur gel d'agarose des produits d'amplification

10µl du milieu réactionnel sont déposés avec 5 µl Glycérol 30%, Orange G 0,025% sur un gel d'agarose à 2% (p/v) contenant 0.01% de Bromure d'éthidium et du tampon TBE (0,1M Tris, 0,09 acide borique, 20mM EDTA). Le marqueur de taille utilisé est un ADN 100pb (Gibco-BRL). Les bandes correspondants au produits d'amplification sont visualisés sous Ultra Violets après une migration de 20 minutes à 100 volts.

5.4 Digestion par restriction enzymatique

La digestion des produits d'amplification est effectuée avec 2u de l'enzyme appropriée par mg d'ADN dans le tampon réactionnel recommandé par les firmes (Tableau 2)

Les produits de RT-PCR sont hydrolysés durant une heure à 37°C. L'électrophorèse sur gel d'agarose est effectuée de la même façon que décrit au paragraphe 5.4.