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par Marie-Laure Caillet
L'intérêt d'un modèle cellulaire.
Sur quelles bases partir pour établir un modèle?
Un projet soutenu par la FRM région Nord-Pas-de-Calais
Exemple de culture de cellules de neuroblastome SKNSH.
Qu'entend-on par modèle? Si on regarde le petit Larousse à « modèle réduit » , on trouve la définition suivante: « reproduction à petite échelle d'une machine, ... ». Un modèle cellulaire de dégénérescence neuronale de type Alzheimer va donc tenter de reproduire au niveau d'une cellule donnée les événéments ou les ( ou certains des) symptômes caractéristiques de la maladie d'Alzheimer.
En effet, les études épidémiologiques, génétiques, histologiques ou biochimiques ont permis d'identifier certains « responsables » de la pathologie. On connaît quelques unes des protéines impliquées (APP, PS1, PS2, Apolipoprotéine E...), on connaît les cellules nerveuses préférentiellement sensibles à la maladie (type de neurone et leur localisation) mais on ne connait toujours pas les mécanismes mis en cause.
Le rôle des protéines identifiées comme responsable de certaines formes de la maladie d'Alzheimer est encore aujourd'hui mal compris. La maladie d'Alzheimer est une maladie hétérogène, complexe et spécifique à l'homme. Pour pouvoir débrouiller l'écheveau complexe tiré de toutes les données bibliographiques, il faut commencer par un modèle relativement simple afin de déterminer le mode d'action de ces protéines: c'est le modèle cellulaire.
L'interêt d'un modèle cellulaire.
I- En travaillant sur des cellules, beaucoup de données peuvent être établies après traitement des cellules ou non par certaines des protéines soupçonnées avoir un rôle dans la maladie:
- les changements morphologiques peuvent etre observés par simple observation au microscope optique.
- La localisation d'une ou plusieurs protéines, lors d'un traitement donné, est observable par fractionnement cellulaire ou par microscopie à fluorescence.
-La viabilité des cellules ou leur mortalité sont quantifiables par dosages,biochimiques ou par microscopie à fluorescence.
- Les répercussions d'un traitement sur la phosphorylation, l'induction ou l'inhibition dÕune protéine donnée sont observables par des méthodes d'analyse biochimique (méthode d'immuno-empreinte, immuno-précipitation...).
II- De plus, le matériel génétique et donc les protéines exprimées par une cellule sont modifiables par des techniques dites de transfection c.a.d. qu'on peut introduire dans une cellule le gène d'une protéine que l'on veut voir exprimer. On peut ainsi rendre le modèle cellulaire plus physiologique ou rechercher l'effet de l'expression intracellulaire de certains facteurs .
Sur quelles bases partir pour établir un modèle?
La maladie d'Alzheimer est une maladie humaine ou l'on observe une forte dégénérescence neuronale. Nous travaillons donc sur des cellules humaines, d'origine neuronale, en lignée continue c.a.d. qui peuvent se multiplier en théorie à l'infini.
Ces cellules vont être traitées par différents agents impliqués dans la maladie:
- On sait que dans la maladie d'Alzheimer, les protéines Tau sont des protéines hyperphosphorylées qui s'agrègent à l'intérieur du neurone sous forme de paires de filaments en hélice. Nous avons alors traité les cellules par un inhibiteur de phosphatases (l'acide okadaique) pour entrainer une hyperphosphorylation des protéines. Dans un tel système, nous avons pu reproduire une hyperphosphorylation de type Alzheimer des protéines Tau (Dupont-Wallois et al., 1995, Soulié et al., 1996, Caillet-Boudin et al.,1996): les protéines Tau ont une masse moléculaire apparente plus élevée, sont plus acides et ont acquis des épitopes phosphoprylés, caractéristiques des protéines tau pathologiques.
- Un des faits marquants de la maladie est une accumulation extracellulaire d'un peptide, appelé peptide Aß, que l'on soupçonne être neurotoxique. Des tests en modèles cellulaires, effectués par nous-même ou par de nombreux autres laboratoires, rèvèlent que ce peptide seul n'est toxique qu'à des doses très supérieures aux doses physiologiques.
D'autres études sont donc entreprises pour vérifier si la toxicité ne pourrait pas résulter d'une combinaison de ce facteur avec d'autres composants.
- l'apolipoprotéine E est un facteur de risque de la maladie. Comment intervient-il? Par effet toxique de manière extracellulaire ou par un effet protecteur au niveau de la phosphorylation des protéines Tau? Nous avons montré que les cellules de neuroblastome humain sur lesquelles on travaille étaient capable de synthétiser cette apolipoprotéine et cette expression physiologique est compatible avec la croissance cellulaire (Dupont-Wallois et al., 1997). Comme deux de ces lignées différaient par l'expression de variants au niveau de cette protéine, nous avons montré que ceci n'entraînait pas de modifications au niveau des sites de phosphorylation sur Tau dans ces deux lignées (Caillet-Boudin, en préparation).
- Nos cellules, malgré leur caractère neuronal, diffèrent d'un neurone de cerveau adulte qu'il soit sain ou de patient Alzheimer. Par exemple, nous avons montré que ces cellules expriment majoritairement une seule isoforme des protéines Tau. Nous pouvons par transfection faire exprimer d'autres isoformes à ces cellules. Le mécanisme de phosphorylation de cette isoforme peut être « décortiqué » en utilisant des anticorps dépendant de la phosphorylation (Dupont-Wallois, 1998). De même, nous pourrions faire exprimer ou surexprimer certaines enzymes responsables de la phosphorylation afin de déterminer lesquelles sont responsables de l'hyperphosphorylation de Tau. Par de telles techniques, il est également possible de rechercher l'effet des protéines identifiées comme responsable de certaines formes de la maladie d'Alzheimer en surexprimant dans les cellules ces protéines mutées ou non.
Mise au point d'un modèle cellulaire de la maladie d'Alzheimer:
un projet développé dans le laboratoire du Dr A. Delacourte, de l'Unité INSERM 422 de Lille (Site CH&U), et soutenu par la FRM région Nord-Pas-de-Calais.
Oublis, pertes de la mémoire, de l'orientation, de la reconnaissance et évolution vers la démence: c'est une vue simplifiée de la maladie d'Alzheimer. A l'heure actuelle, cette démence liée à l'âge est un fléau social. Il suffit de regarder et d'écouter autour de nous pour s'apercevoir qu'un proche, un voisin, un collègue est directement confronté à cette maladie. Celle-ci se développe sur plusieurs décennies, affectant spécifiquement un organe inaccessible aux analyses, à savoir le cerveau bien protégé dans sa boîte cranienne. Les chercheurs savent que la maladie d'Alzheimer résulte de la perte de certains neurones (cellules nerveuses).
Deux types de lésions très caractéristiques envahissent progressivement la presque totalité du cerveau au cours de la maladie d'Alzheimer:
- les plaques séniles qui sont des amas sphériques d'un constituant nommé « peptide Aß »
- la dégénérescence « neurofibrillaire » formée de filaments anormaux qui s'accumulent dans les cellules nerveuses. Ces filaments sont constitués de protéines tau pathologiques. L'équipe de A. Delacourte a beaucoup contribué à la connaissance de ces protéines Tau modifiées, en démontrant que chaque type de maladie neurodégénérative pouvait être reconnue par son profil particulier en protéines Tau. Cette découverte est un apport important pour le diagnostic. Elle l'est également pour la mise au point de modèle cellulaire.
Qu'entend-on par modèle?
Dans le cas de notre recherche, un modèle est une représentation simplifiée des évènements anormaux qui caractérisent la maladie d'Alzheimer. Les modèles sont généralement cellulaires ou animaux. S'il s'agit d'un modèle cellulaire, les cellules nerveuses cultivées au laboratoire devront présenter une dégénérescence similaire à celle de la maladie d'Alzheimer. Il est alors possible de rechercher des produits qui s'opposent à la formation des plaques séniles ou de la dégénérescence neurofibrillaire.
Que faut-il pour travailler sur un tel modèle?
Il faut tout l'environnement nécessaire à la culture cellulaire, à savoir une hotte à flux laminaire pour travailler dans des conditions stériles, un incubateur pour faire pousser les cellules, un microscope pour observer les cellules. Il faut également une bonne connaissance dans le domaine fondamental et clinique de la maladie d'Alzheimer.
Un modèle cellulaire est déjà en place dans le laboratoire. Nous lui apportons régulièrement des améliorations, afin qu'il reflète encore mieux les anomalies de la maladie d'Alzheimer. L'aide financière donnée par la FRM région Nord-Pas-de-Calais a permis l'installation d'un poste de culture cellulaire. Il est utilisé par un étudiant en DEA (Diplôme d'Études Approfondies), qui va poursuivre le travail déjà engagé.
Culture de cellules de neuroblastome SKNSH.
Notez les longs prolongements neuritiques.
Le modèle cellulaire est une étape transitoire qui doit permettre la compréhension des mécanismes pathologiques, avant de passer aux modèles animaux. C'est une étape nécessaire afin de rechercher par la suite les molécules pharmaceutiques capables de retarder ou mieux d'annihiler ces mécanismes pathologiques.