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CULTURE CELLULAIRE
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-PRIMAIRES DE NEURONES CORTICAUX II - METHODES D'INDUCTION DE LA MORT NEURONALE |
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Les cultures sont réalisées à partir de foetus de rats Wistar. La phase mitotique du développement neuronal s'achève au cours du deuxième tiers de la gestation chez le rat : les cellules sont prélevées à cette période afin que la phase de différenciation neuronale s'effectue in vitro. A - Prélèvement des cellules Les foetus sont prélevés par césarienne au 17ème jour de développement embryonnaire sur des rates Wistar gestantes. Les cerveaux sont extraits dans des conditions stériles puis immergés dans du tampon phosphate salin (PBS) supplémenté en glucose et antibiotiques (Tableau 1). Après ablation des méninges, le cortex cérébral est disséqué puis découpé en petits fragments. Les fragments corticaux obtenus sont centrifugés brièvement (2 minutes, 300g) puis resuspendus dans du milieu de culture de base (Minimum Essential Medium avec sels de Earle supplémenté en L-glutamine, glucose et antibiotiques) (Tableau 2). Une dissociation mécanique des fragments corticaux est réalisée par passages itératifs dans une pipette pasteur. La suspension cellulaire obtenue est centrifugée pendant 10 minutes à 300g. Le culot cellulaire obtenu est alors repris dans un volume approprié de milieu de culture, après évaluation de la densité cellulaire par comptage sur cellule de Thoma. B - Support de culture Deux types de support sont utilisés en fonction de la nature des analyses à effectuer sur les cultures : - boîtes de Petri de 35 mm (Nunc) permettant de récolter les cellules pour l'extraction des ARN. Dans ce cas, les cellules sont ensemencées à la densité de 1,5.106 cellules par boîte. - plaques de culture de 24 puits (Nunc) au fond desquels on place une lamelle de verre de 14 mm : ce support est utilisé pour les études en immunohistochimie ou en hybridation in situ. Les cellules sont alors ensemencées à la densité de 25.104 cellules par puits. Dans les deux cas, le support de culture est préalablement recouvert d'une matrice de poly-L-lysine (PM 30 000 - 70 000 kDa, Sigma) : une solution de poly-L-lysine à 5µg/ml est déposée dans les boîtes ou les puits et incubée pendant au moins une heure à 37°C. Après polymérisation de la poly-L-lysine, les boîtes ou les puits sont rincés au PBS puis ensemencés. C - Milieu de culture Les cellules sont ensemencées dans du MEM avec sels de Earle (Gibco) supplémenté en L-glutamine, glucose, antibiotiques, sérum de veau foetal, albumine sérique bovine, sélénium, insuline, progestérone, putrescine et apo-transferrine (tableau 2). Les cultures sont ensuite maintenues à 37°C dans un incubateur sous 5 % de CO2/ 95 % d'air et à saturation en vapeur d'eau. Pour certaines expérimentations (cf Chapitre Résultats, 2ème partie), les cellules sont traitées après 8 jours de culture sans changement de milieu. Pour d'autres études (cf Chapitre Résultats, 1ère partie), le milieu de culture est renouvelé tous les 4 jours et les cellules sont traitées après 10 jours de culture. Pour les deux dernières parties de ce travail, ce protocole a été modifié : après 4 jours de culture, le milieu est remplacé par du milieu de base supplémenté par 5 % de sérum de veau fÏtal (SVF) et 2 µM de 5-fluorodéoxyuridine et d'uridine afin de limiter la prolifération des cellules gliales ; ce milieu est remplacé 3 jours plus tard par du milieu de base supplémenté par 5 % de SVF et les cultures sont traitées au 10ème ou 11ème jour de culture. Ces modifications sont inhérentes à la qualité des différents sérums utilisés au cours de ce travail.
1.1 Entretien de la lignée des NT2 et différenciation cellulaire selon la méthode de Stratagène L'entretien des cellules de tératocarcinome humain NT2 se fait en milieu DMEM complet (DMEM (Boerhinger Mannheim) 10% Sérum de Veau Foetal (Gibco-BRL), 2mM glutamine (Gibco-BRL) et 50µg/ml pénicilline/streptomycine (Gibco-BRL)). La lignée est divisée au 1/5 deux fois par semaine et le milieu est changé tous les 2 jours. Les cellules NT2 peuvent être différenciées en neurones post-mitotiques du système nerveux central par traitement à l'acide rétinoïque(AR). 8.105 cellules sont ensemencées dans une boîte de 75 cm2 et sont maintenues 4 semaines en DMEM complet contenant 10-8M d'AR et un anti-fongique, l'amphotéricine B à 1mg/ml (Sigma). Au terme de ce traitement, les cellules sont divisées au 1/3 et maintenues 3 jours en milieu DMEM complet. Les cellules sont ensuite traitées pendant 2 semaines avec des inhibiteurs mitotiques (1µM Cytosine-b-D-Arabinofuranoside, 10µM 5-Fluoro-2'-deoxyuridine, 10µM Uridine ; Sigma) rajoutés dans le milieu de culture. A cette étape, la population cellulaire est mixte avec une couche de cellules de type neuronal (hNT) poussant sur une couche de cellules de support non neuronales (NN). Afin d'enrichir la culture en cellules différenciées, les cellules de type neuronal sont décrochées par traitement " doux " à la trypsine/EDTA 1X (Gibco-BRL) alors que la majorité des cellules non neuronales NN restent accrochées à la boîte. Les cellules récupérées sont alors, soit centrifugées puis congelées afin d'être analysées en RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ou par immunoempreinte, soit repiquées sur Laminine (0,5mg/cm2-Sigma) ou sur Matrigel dilué au 1/34 (Becton Dickinson). La population est alors constituée à 90% de cellules de type neuronal hNT. D - Caractérisation des cellules en culture La caractérisation des neurones dans nos cultures est réalisée par le marquage immunohistochimique des neurofilaments, filaments intermédiaires spécifiques des cellules neuronales, à l'aide de différents anticorps : anticorps polyclonal pan-anti-neurofilament (Affinity), anticorps monoclonal anti-neurofilament 200 kDa (Amersham), anticorps monoclonal anti-neurofilament 150 kDa (clone 2H3, DSHB). Les cellules sont utilisées au bout de 8 à 11 jours de culture selon les expérimentations. A ce stade, le pourcentage de cellules non neuronales est évalué par des études immunohistochimiques. Les cellules de type astrocytaire représentent la principale population non-neuronale dans nos cultures. Le double marquage immunohistochimique des astrocytes et des neurones (respectivement par un anticorps polyclonal anti-GFAP et par un anticorps monoclonal anti-neurofilament 200 kDa) permet d'évaluer la proportion d'astrocytes présente dans nos cultures (Figure 1). Cette proportion varie entre 5 et 15 % (selon le sérum utilisé et selon que les cultures sont traitées ou non par un agent antimitotique). L'évaluation du pourcentage de macrophages présents dans nos cultures a été réalisée dans une étude antérieure : il est inférieur à 5 % dans notre modèle (Diop et al, 1994). La différenciation neuronale dans notre modèle a été évaluée dans un précédent travail par l'analyse morphologique des cultures d'une part et le marquage immunohistochimique de la synaptophysine d'autre part (Sindou et al, 1994b). La formation des neurites est observable dès le 1er jour de culture et les réseaux neuritiques se développent et se ramifient rapidement au cours des 4 à 6 premiers jours de culture. La synaptophysine, protéine membranaire des vésicules synaptiques considérée comme un marqueur de la différenciation neuronale (Leclerc et al, 1989 ; Phelan et al, 1992) est exprimée dès le 4ème jour de culture. A partir du 7ème jour, son expression est détectée dans la plupart des neurones au niveau du corps cellulaire et des prolongements (Sindou et al, 1994b).
II - METHODES D'INDUCTION DE LA MORT NEURONALE (F. Esclaire, Limoges) A - Excitotoxicité Comme nous l'avons vu précédemment (Chapitre 1, 2ème partie), la mort neuronale peut être induite in vitro, par l'exposition des neurones à de fortes concentrations d'acides aminés excitateurs. Le protocole utilisé dans notre travail consiste en une exposition brève (8 à 15 minutes selon les études) à des concentrations largement supraphysiologiques de glutamate (50 à 500 µM). Ce type de stress excitotoxique est connu pour déclencher à la fois de la nécrose et de l'apoptose dans d'autres types de cultures primaires de neurones (Ankarcrona et al, 1995). Le glutamate (Sigma) est préparé à la concentration appropriée dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Gibco-BRL) sans Mg++ et supplémentée en Ca++ (1,8 mM), glucose (18 mM) et glycine (5 µM). A la fin de l'exposition, la solution de glutamate est retirée, les cultures sont rincées rapidement avec du milieu de culture de base (tableau 2) puis maintenues à l'incubateur dans du milieu de culture standard pendant 1 à 24 heures selon les expérimentations. B - Exposition au méthylazoxyméthanol (MAM) Le MAM a été fourni par l'équipe du Professeur P. Spencer (Université de Portland, Oregon, USA). Le MAM est préparé à la concentration appropriée (10, 50 ou 100 mM) dans du milieu de culture standard (tableau 2). Les cultures sont exposées à cette solution pendant 12 heures puis rincées rapidement (avec du milieu de culture) et maintenues à l'incubateur dans du milieu de culture standard pendant 24 à 36 heures selon les expérimentations (Chapitre Résultats, 3ème partie). C - Privation de sérum Pour les expériences de privation de facteurs trophiques, le milieu de culture est remplacé durant 24 heures par du milieu de culture de base (tableau 2) ne contenant ni SVF ni hormones. Un rinçage rapide par du milieu de base est effectué préalablement afin d'éliminer toute trace de facteur trophique (les facteurs de croissance étant actifs à des concentrations de l'ordre du nanomolaire voire du picomolaire). D - Exposition au peptide ß-amyloïde La neurotoxicité du peptide ß-amyloïde (qu'il s'agisse du peptide 1-42, du peptide 1-40 ou du fragment 25-35) a été largement démontrée in vitro (cf Etude bibliographique, Chapitre 2). Les cultures sont exposées durant 24 heures au peptide ß-amyloïde 25-35 (Sigma) à différentes concentrations (10 ou 25 µM). Un traitement de contrôle est réalisé en parallèle avec une solution de peptide de séquence inversée (ß-amyloïde 35-25, Sigma) préparée dans les mêmes conditions. La solution de peptide est préparée dans du milieu de culture standard (tableau 2). Pour certaines expérimentations, la solution de peptide ß-amyloïde est incubée pendant 4 jours à 37°C avant d'être mise en contact avec les cultures. 1.3 Préparation d'échantillons cellulaires Les culots de cellules ont été récupérés à différents stades de différenciation afin d'être analysés en RT-PCR ou par immunoempreinte. Pour cela, les cellules sont rincées au PBS 1X (Gibco-BRL) à 4°C puis décrochées par du Versene à 4°C (Gibco-BRL) pendant 10 minutes. Les cellules sont centrifugées 5 minutes à 1500 rpm à 4°C. Après aspiration du surnageant, le culot cellulaire est soit congelé en azote liquide et conservé à ø80°C pour l'extraction d'ARNs, soit repris dans une solution de Laemmli (50mM Tris, 2% SDS, 10% glycérol, 10mM EDTA, 0,1% bleu de bromophénol, 100mM DTT) afin d'être analysé par la technique d'immunoempreinte.
III - TRAITEMENTS PHARMACOLOGIQUES (F. Esclaire, Limoges) Le blocage des récepteurs ionotropiques du glutamate a été effectué dans certaines expérimentations (Chapitre Résultats, 1ère et 2ème parties). Deux antagonistes ont été utilisés : - le MK 801 (RBI), antagoniste spécifique des récepteurs NMDA (20 mM) - le CNQX (TOCRIS), antagoniste spécifique des récepteurs AMPA/kainate (20 mM). Les antagonistes ont été introduits dans le milieu de culture 15 minutes avant et pendant l'exposition des cultures au glutamate ou au MAM. Le blocage de la transcription cellulaire a été réalisé par l'adjonction dans le milieu de culture de 0,1mg/ml d'actinomycine D (Sigma) pendant et 3 heures après l'exposition au glutamate. Le blocage des caspases a été effectué à l'aide de peptides synthétiques inhibiteurs (Chapitre Résultats, 4ème partie) : - le peptide YVAD (Ac-YVAD-CHO, Neosystem), inhibiteur des caspases de type 1 (ICE) a été utilisé à la concentration de 50mM , - le peptide DEVD (Ac-DEVD-CHO, Neosystem ), inhibiteur spécifique des caspases de type 3, a été utilisé à la concentration de 50mM. Ces peptides ont été introduits pendant toute la durée de l'exposition des cultures au peptide b-amyloïde 25-35 (24 heures).
IV - EVALUATION DE LA MORT NEURONALE (F. Esclaire, Limoges) A - Dosage de l'activité lactate déshydrogénase (LDH) 1 - Principe Cette technique mesure l'intégrité membranaire : les cellules dont la membrane a été rompue libèrent leur contenu cytosolique, et notamment de la LDH, dans le milieu extracellulaire. La quantité de LDH relarguée dans le milieu de culture est proportionnelle à la mort cellulaire. La mesure de l'activité LDH permet d'évaluer non seulement la mort cellulaire nécrotique (caractérisée par une rupture précoce de la membrane plasmique) mais aussi une partie de la mort cellulaire apoptotique : les cellules apoptotiques ne sont, pour la plupart, pas phagocytées (du fait de la très faible proportion de cellules phagocytaires dans nos cultures) et finissent par perdre leur intégrité membranaire au stade ultime du processus apoptotique ("nécrose secondaire"). La mesure de l'activité LDH dans le milieu de culture est effectuée par un dosage enzymatique colorimétrique à l'aide du kit LDH (Boehringer-Mannheim). Pour chaque puits ou boîte de culture, deux prélèvements de 50 µl de surnageant sont effectués. A chaque échantillon de 50 µl de surnageant (déposé dans une plaque de 96 puits de type Elisa) sont ajoutés 50 µl de réactif du kit contenant: - du lactate (substrat de l'enzyme), - de l'iodotétrazolium (colorant), - de la diaphorase/NAD+ (catalyseur). En présence de LDH, le lactate est transformé en pyruvate et la NAD est alors transformée en NADH. En présence de NADH, le colorant jaune (iodotétrazolium) est transformé en formazan (rouge). Après 30 minutes d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, la quantification de la réaction est effectuée par la mesure de la densité optique (DO) à 492 nm sur spectrophotomètre. 2 - Calcul du pourcentage de mort neuronale Cette technique permet une évaluation relative de la mort (ou de la survie) neuronale. Elle nécessite l'utilisation de deux contrôles : - un contrôle "négatif" (C0) qui correspond à 0 % de mort neuronale (ou 100% de survie). Ce contrôle est obtenu avec le surnageant des cultures témoins; - un contrôle "positif" (C100) qui correspond à 100% de mort (ou 0% de survie) neuronale. Il est réalisé en traitant les cultures avec une très forte concentration de glutamate (500 µM) pendant plusieurs heures (12 ou 24 heures selon les expérimentations). Ce traitement provoque la dégénérescence de la quasi-totalité des neurones sans affecter de façon significative la survie des cellules gliales. Le pourcentage de mort neuronale est évalué en calculant le rapport suivant: ( DOx - DOC0 ) / ( DOC100 - DOC0 ) avec : - DOx = densité optique obtenue avec le surnageant des cultures traitées - DOC0 = densité optique du contrôle "négatif" (0%de mort) - DOC100 = densité optique du contrôle "positif" (100% de mort) B - Evaluation de la mort neuronale par double-marquage fluorescent diacétate de fluorescéine/iodure de propidium Ce marquage est réalisé sur les cultures vivantes sans fixation préalable. Les cultures sont incubées pendant 5 minutes avec le diacétate de fluoresceine (DF, 1µg/ml) et l'iodure de propidium (IP, 1 µg/ml). L'IP est hydrophile : il pénètre uniquement dans les cellules dont les membranes sont rompues et se fixe de façon irréversible sur l'ADN nucléaire. Le DF est lipophile : il traverse les membranes et pénètre dans les cellules vivantes où il est dégradé par des estérases libérant la fluorescéine, qui colore ces cellules en vert. Sous microscope inversé à fluorescence, le comptage des cellules dont le noyau est marqué en rouge (cellules mortes marquées par l'IP) et des cellules marquées en vert (cellules vivantes dégradant le DF) permet d'établir le pourcentage de mort (ou de survie) cellulaire dans chaque condition expérimentale. C - Evaluation de la mort nécrotique et apoptotique par le double marquage fluorescent SYTO13 / iodure de propidium La détermination du type de mort cellulaire (apoptose ou nécrose) est réalisée grâce à l'utilisation de deux sondes fluorescentes, le SYTO-13 (Molecular Probe) et l'iodure de propidium (Sigma). Ces deux sondes marquent l'ADN : l'une en vert (SYTO-13), l'autre en rouge (iodure de propidium). Le SYTO-13 a la propriété de pénétrer dans les cellules dont la membrane plasmique est intacte. A l'inverse, pour que l'iodure de propidium se fixe sur l'ADN, il est nécessaire que les membranes soient lésées ou perméabilisées. L'évaluation de l'état apoptotique, nécrotique ou normal des cellules est déterminée en fonction de deux paramètres : la coloration du noyau (rouge ou vert) et sa morphologie (noyau de taille normale, augmentée ou réduite, présentant ou non une fragmentation). Ce double marquage est réalisé sur les cultures vivantes sans fixation préalable : les cultures sont incubées pendant 15 minutes à 37 °C avec le SYTO-13 (40 µg/ml dans du milieu de base) et l'iodure de propidium (5 µg/ml dans du milieu de base). L'examen des cellules sous microscope inversé à fluorescence permet le comptage : - des cellules vivantes (noyaux verts sans modification de taille) - des cellules apoptotiques (noyaux condensés ou fragmentés colorés en vert pour l'apoptose "récente" ou en rouge pour l'apoptose "ancienne") - des cellules nécrotiques (noyaux rouges de taille augmentée ou normale).
V - EVALUATION DE L'APOPTOSE NEURONALE (F. Esclaire, Limoges) A - Mise en évidence des modifications morphologiques nucléaires liées à l'apoptose Les modifications morphologiques nucléaires liées à l'apoptose sont mises en évidence par la coloration de l'ADN par un marqueur fluorescent, le 4',6-diamidino-2-phénylindole ou DAPI (Sigma). Ce marquage est réalisé sur les cellules préalablement fixées (paraformadéhyde 4% ou 1% selon les expérimentations) : les cellules sont incubées pendant 2 minutes à température ambiante avec une solution de DAPI à 1µg/ml dans du PBS. Après un rinçage rapide au PBS, les lamelles marquées peuvent être montées sur lame et examinées au microcope à fluorescence. Les noyaux apparaissent fluorescents en bleu et peuvent être différenciés selon des critères morphologiques : - les noyaux des cellules apoptotiques présentent une taille réduite (condensation nucléaire) pouvant être associée à un aspect fragmenté ; ces noyaux apoptotiques présentent généralement une fluorescence intense (Figure 3); - les noyaux des cellules non apoptotiques présentent une taille non réduite avec une fluorescence peu intense (Figure 3). Le comptage de ces deux types de cellules permet d'établir le pourcentage de mort cellulaire apoptotique dans les différentes conditions expérimentales étudiées. Cette technique peut être combinée à d'autres types de marquage (immunohistochimie, hybridation in situ) ; dans ce cas, la coloration par le DAPI doit être réalisée en dernier lieu (après toute autre manipulation) pour conserver une fluorescence de bonne qualité. B - Evaluation de l'apoptose par le marquage in situ des extrémités 3' libres de l'ADN nucléaire : méthode TUNEL Le marquage des cellules apoptotiques par la méthode TUNEL ("Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling") est réalisée à l'aide d'un kit ("détection et quantification de l'apoptose in situ", Boehringer Mannheim). Ce marquage permet de mettre en évidence in situ la fragmentation de l'ADN nucléaire résultant de l'activation des endonucléases au cours de l'apoptose. Cette méthode est basée sur le marquage des extrémités 3'-OH libres de l'ADN par la terminal transférase (tdt) : cette enzyme catalyse l'accrochage de nucléotides marqués à la fluorescéine au niveau des extrémités 3'-OH libres (à ce stade, le marquage peut être examiné au microcope à fluorescence). La fluorescéine est ensuite détectée par un anticorps anti-fluorescéine couplé à la péroxydase. Le marquage est révélé en utilisant la diaminobenzidine (0,05 % dans du PBS) comme chromogène. Après contre-coloration au bleu de toluidine et montage des lamelles, les cultures sont examinées au microscope optique. Les cellules apoptotiques sont caractérisées par un marquage nucléaire brun et les cellules non apoptotiques par l'absence de marquage brun (Figure 4). Le comptage de ces 2 catégories de cellules permet d'établir le pourcentage de mort cellulaire apoptotique dans les différentes conditions expérimentales étudiées. Un témoin négatif est réalisé au cours de chaque expérimentation : sur une lamelle, la réaction est effectuée en remplaçant l'enzyme tdt par de l'eau distillée. Aucun marquage ne doit être détecté.
VII - IMMUNOHISTOCHIMIE (F. Esclaire, Limoges) A - Liste des anticorps utilisés Anticorps primaires : - anticorps polyclonal pan-anti-neurofilament (Affinity), dilution 1/500 - anticorps monoclonal anti-neurofilament 200 kDa (Amersham), dilution 1/250 - anticorps monoclonal anti-neurofilament 150 kDa (clone 2H3, DSHB), dilution 1/10 - anticorps polyclonal anti-GFAP (Dako), dilution 1/500 - anticorps polyclonal anti-c-jun (Santa Cruz Biotechnology), dilution 1/500 Anticorps secondaires : - anticorps anti-Ig de lapin couplé à la peroxydase (Dako), dilution 1/100 - anticorps anti-Ig de souris couplé à la peroxydase (Dako), dilution 1/100 - anticorps anti-Ig de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Dako), dilution 1/100 - anticorps anti-Ig de souris couplé à la phosphatase alcaline (Dako), dilution 1/100
B - Immunohistochimie en peroxydase Les cultures sont fixées dans du paraformaldéhyde (4 % dans du PBS; pH 7,4) pendant 30 minutes à température ambiante puis rincées 3x5 minutes dans du PBS (pH 7,4). L'activité des peroxydases endogènes est inhibée par un traitement à l'eau oxygénée (H2O2 , 3 %) pendant 10 minutes, puis les cultures sont à nouveau rincées 3x5 minutes dans du PBS. Les sites antigéniques non spécifiques sont saturés par une incubation de 30 minutes à température ambiante dans du sérum de cheval (DAP) dilué à 10 % dans du PBS. Les cultures sont ensuite incubées pendant au moins une heure en présence de l'anticorps primaire dilué à la concentration souhaitée dans du PBS contenant 1 % de sérum de cheval. Après 3 rinçages de 5 minutes au PBS, les cultures sont incubées au moins 45 minutes en présence de l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase. Après 3 rinçages de 5 minutes au PBS, la réaction est révélée par une incubation de 5 à 15 minutes avec une solution composée de H2O2 , 0,03%/ DAB, 0,05 % dans du PBS. Ce marquage peut être suivi d'une contre-coloration au bleu de toluidine (0,25%) ou d'un second marquage immunohistochimique avec un anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline. Pour chaque expérimentation, un témoin négatif est réalisé en remplaçant l'anticorps primaire par du tampon PBS : aucun marquage brun ne doit apparaitre après révélation.
C - Immunohistochimie en phosphatase alcaline Le protocole est identique à celui utilisé pour l'immunohistochimie en peroxydase à trois exceptions près : - Les rinçages et les dilutions des réactifs sont effectués avec du TBS (pH 7,4) et non du PBS. - L'anticorps secondaire est couplé à la phosphatase alcaline (et non à la peroxydase). - La révélation s'effectue avec du Fast blue (1mg/ml, Sigma) préparé dans un tampon composé de naphtol AS-MX phosphate, 2mg (Sigma)/diméthylformamide, 100 µl (Sigma) / tampon tris-Hcl (0,1M, pH 8,2), 9,9 ml (Sigma). La réaction enzymatique fait apparaitre une coloration bleue après une incubation de 5 à 15 minutes avec cette solution. Pour chaque expérimentation, un témoin négatif est réalisé en remplaçant l'anticorps primaire par du tampon TBS : aucun marquage bleu ne doit apparaitre après révélation.
VII - ANALYSES STATISTIQUES (F. Esclaire, Limoges) Pour toutes les expérimentations, au minimum 3 boîtes ou 3 puits de culture ont été utilisés pour chaque condition expérimentale. Les expérimentations sont répétées 3 fois. Pour tous les comptages en microscopie (évaluation de la mort ou de l'apoptose neuronale, marquages immunohistochimiques ou par hybridation in situ), le comptage d'au moins 300 cellules par boîte ou puits de culture a été réalisé. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SD ou ± SEM. L'analyse statistique des résultats est effectuée par le test ANOVA (analyse de variance) à 95 % d'intervalle de confiance, validé par le test de Bartlett. Expression des résultats : NS = non significatif * = p< 0,05 ** = p< 0,01 *** = p< 0,001 |
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