L’APP appartient à la superfamille des APP, conservée au cours de l’évolution. Cette famille inclut les protéines APLP-1 et –2 chez les Mammifères, APP747 chez le Xénope, APL-1 chez C. elegans, et APPL (APP-like) chez la Drosophile. L’APLP-1 possède une séquence protéique similaire à 94 % à celle de l’APP, et une séquence en acides aminés identique à 89 %1.

Depuis la fin des années 1980, le nombre d’études au sujet de l’APP et de ses fragments protéolytiques ne cesse d’augmenter. Dès 1988, Selkoe et al. démontrent sur tissu humain et cellules en culture que l’APP est une molécule membranaire de poids moléculaire compris entre 110 et 135 kDa11. Les marquages de tissus humains avec un anticorps anti APP-Cter correspondent à 4 bandes de poids moléculaire respectif 108, 118, 127, et 136 kDa. L’étude a en outre porté sur de nombreuses aires du cortex humain, ainsi que sur des tissus de nombreuses espèces modèles (rat, vache, chat et singe). Cette publication insiste sur l’hétérogénéité des formes de l’APP, due principalement aux variations d’épissage et de glycosylation.

Une étude a été réalisée en 1994 par l’équipe de Wasco3,4 sur les protéines synthétisées in vitro à partir des cDNA de APP, APLP-1 et APLP-2. Les protéines séparées sur gel SDS-PAGE 9 % ont un poids moléculaire apparent de :

• APP695 : 110 kDa
• APP751 : 130 kDa
• APLP-1 : 95 kDa
• APLP-2 : 135 kDa.

L’APLP-2 est comme l’APP une proténe à expression ubiquitaire, tandis que celle de l’APLP-1 est limitée aux cellules du SNC. L’APLP-1 et –2 subissent également un clivage protéolytique, et leurs produits de sécrétion se retrouvent dans le surnageant de cellules en culture, dans le plasma et dans le LCR.

L’expression chez P. pastoris12 résulte dans la sécrétion de deux isoformes majeurs, de poids moléculaires respectifs 115 (sAPP-a) et 105 kDa (sAPP-b), détectés dans le surnageant des cultures bactériennes par un anticorps Nter. Les produits sécrétés ne contiennent pas le domaine Cter (pas de marquage par un anticorps anti-Cter) : il y a comme dans les modèles cellulaires humains troncation du segment C-terminal avant sécretion. D’autres bandes de 65 kDa et moins sont souvent observées et correspondent à des produits de dégradation.

                  Tranformations post-traductionnelles

O- et N-glycosylations, sulfation, liaison au glycosaminoglycane chondroitin-sulfate.

Certaines études s’attachent à isoler ces modifications post-traductionnelles. On notera par exemple l’utilisation de tunicamycine pour inhiber la N-glycosylation, oucelle de jacaline-agarose pour la précipitation des protéines O-glycosylées1.

                  Sa fonction

L’APPs est considéré comme un peptide de signal qui permet la coordination des réponses entre les cellules cibles, neuronales ou non (pour une revue, voir réf. 13). Plus précisément, les fonctions suivantes ont été mise en évidence :

• stimulation de le prolifération de fibroblastes déficients en APP
• facteur de croissance épithélial dans des thyrocytes
• stimulation de la croissance de neurites dans des cellules de neuroblastomes
• protection des neurones lors de pression métabolique
• facteur trophique sur des neurones du cortex cérébral.

De nombreux sites de liaison à l’APP-695 ont été mis en évidence récemment dans la zone sub-ventriculaire, où il augmenterait la prolifération des cellules progénitrices adultes. Le récepteur de l’APPs est encore inconnu bien que dans le cas de l’APPs sécrété par les plaquettes, il soit probablement de la famille des « class A scavenger receptors »5. Le domaine de l’APPs de liaison au récépteur peut être le domaine Kunitz, qui peut se lier à la molécule LRP ou « LDL receptor-related protein ». Cependant, le domaine Kunitz n’est pas indispensable. En effet, on a montré que l’APP-695 peut également se lier à un récepteur, bien que ne possédant pas le domaine.

Plusieurs stimuli, probablement des des facteurs essentiels contenus dans le sérum, contribuent au maintien d’une production et d’une sécretion équilibrée des sAPP dans les cellules en cultures. Il semblerait par exemple que la liaison de l’APP –qui peut être considéré comme un récepteur membranaire- à son ligand (la F-spondine est le seul ligand connu à l’heure actuelle) régule le clivage de l’APP. Il en est de même pour l’interaction intracellulaire entre l’APP membranaire et le LRP, qui semble augmenter le processing protéolytique de l’APP14. D’autre part, une corrélation entre phosphorylation et métabolisme de l’APP a été mise en évidence. La stimulation des récepteurs muscariniques à l’acétylcholine favorise la sécrétion de sAPP9, tout comme les estres de phorbol, qui activent directement la PKC. L’inhibition des phosphatases mène également à une augmentation des sAPP sécrétés.

D’autre part, on a observé que le ratio sAPP-b / sAPP-a sécrétés par des neurones humains augmente en absence de sérum, avec une forte réduction de la quantité totale de sAPP sécrété10.

Sécrétion

La concentration de sAPP dans la circulation est estimée à environ 60pM. Toutefois, cette concentration ne correspond probablement pas à celle de l’espace inter-cellulaire cérébral. Quelques études ont été réalisées dans le but de montrer la localisation des sAPP dans le tissu cérébral8.

                  Résultats sur le LCR

Les résultats des études visant à comparer les niveaux de sAPP dans le LCR de patients témoins et atteints de la maladie d’Alzheimer sont contradictoires6,7, probablement du fait de l’utilisation d’anticorps ne disciminant pas entre les formes a et b, ou entre l’APP et les APLP.

Une technique mise en œuvre récemment par Olosson et al.6consiste en un test ELISA spécifique. Les peptides standards sAPP-a et sAPP-b sont synthétisés dans un système bactérien à partir de cDNA amplifié par PCR, afin de réaliser les contrôles. L’anticorps de capture est le 8 E 5, qui reconnaît un épitope en Nter des sites de clivage. Les anticorps 6 E 10 et 192 reconnaissent respectivement les formes a et b de sAPP.  Avec cette méthode, aucune différence significative dans les niveaux de sAPP-a et de sAPP-b n’est mise en évidence entre le groupe témoin et le groupe de malades d’Alzheimer.

                  Les modèles cellulaires utilisés

FRTL-5 (F12 +sérum)

P12 (DMEM + sérum)

PC12 (DMEM / F12 sans sérum)2

B104 (DMEM + sérum)

N2ab de souris (DMEM + sérum)

Cellules de neuroblastomes IMR-32 (DMEM / F12 1 :1 + sérum)

Cellules de Souris L-M (TK-)

Cellules embryonnaires humaines de rein 293

Cellules de neuroblastomes SH-SY5Y (RPMI 1640 + sérum)

Cellules NT2N9 (Opti-MEM + sérum)

Cellules COS-7 (DMEM + sérum)1

Cellules H4 de neurogliome humain (DMEM + sérum)2

De nombreuses études utilisent d’autre part l’expression de l’APP par des systèmes orthologues, souvent bactériens.

Certains contrôles sont effectués concernant la prolifération des cellules, leur activité réplicative (synthèse d’ADN), le taux d’apoptose.

Anticorps connus

Afin de caractériser avec précision la spécificité des anticorps, plusieurs techniques sont envisageables. Entre autres, il est possible de pré-incuber l’anticorps avec différents peptides de synthèse, et d’analyser dans quels cas le signal observé est aboli. Il y a alors compétition entre le peptide de synthèse et le peptide sécrété, qui démontre la spécificité de l’anticorps vis-à-vis de ce peptide.

Une autre approche utilise l’expression de protéines recombinantes de l’APP se terminant soit au site a soit au site b, par des systèmes modèles bactériens, puis l’analyse des surnageants avec les différents anticorps.

Enfin, on peut effecter un dot blot sur différents peptides de synthèse.

D’autre part, en comparant le marquage du sérum brut et du sérum pré-incubé avec le peptide immunisant, on détecte les bandes non-spécifiques.

Paliga et al.  Eur. J. Biochem. 250, 354-363. 1997

2 Webster et al. Biochem. J. 310, 95-99. 1995

3 Wasco et al. Proc Natl Acad Sci USA, 89 : 10758-10762. 1992

4 Bush et al. J Biol Chem, 269(43) ; 26618-26621. 1994

5 Santiago-Garcia et al. J Biol Chem. 276(33):30655-61. 2001

6Olosson et al. Exp. Neurol. 183, 74-80. 2003

7Sennvik et al. Neurosc Letters. 278, 169-172. 2000

8Sennvik et al. J. Cell. Mol. Med. 8(1), 127-134. 2004

9  Wolf et al. J. Biol. Chem. 270(9), 4916-4922. 1995

10Villa et al. Neurochem. Int. 41, 261-269. 2002

11Selkoe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 7341-7345. 1988

12Le Brocque et al. Biochem. 37, 14958-65. 1998

13 Wilquet & De Strooper. Cur. Op. Neurobiol. 14, 582-588. 2004.

14 Yoon et al. J. Biol. Chem. 2005 Mar 16.